周 荧，王 頔，聂 飞*

（1.贵州省生物研究所，贵州贵阳 550009；2.湄潭县林业局，贵州遵义 564100）

蓝莓为丛生灌木，生产上一般采用组培和扦插2 种繁殖方式。蓝莓为浅根系植株，无主根，根系纤细无根毛［1］。蓝莓喜酸性疏松土壤，因此选择抗旱性强的品种对蓝莓苗木在不同生态区适应性极其重要。

贵州蓝莓种植地多为山地，喀斯特地貌，小气候类型多，主要土壤类型为黄壤、红壤、黄棕壤、棕壤、石灰土和水稻土这几大类，土壤保水能力差，土壤暂时性干旱频繁发生［2-3］。干旱胁迫是植物常见的逆境胁迫之一，不仅制约植物的生长发育，并且对植物的结构产生影响［4］。植物对干旱胁迫的响应过程和受胁迫程度与植物自身的抗性相关，植物会从表型、生理功能、分子结构、生化代谢、形态适应、生长发育、生物量及产量等多种形式表现［5-7］。因此，从植物生理学及形态特征出发，是开展干旱胁迫下植物生理生化反应及叶片解剖结构的系统研究的重要方法。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验材料为贵州瑞蓝果业有限公司麻江县种苗繁育基地“莱克西”和“灿烂”2 个蓝莓品种的移栽后1.5年生组培和扦插容器苗。“灿烂”组培苗用CLZ 表示，“灿烂”扦插苗用CLQ 表示，“莱克西”组培苗用LKXZ 表示，“莱克西”扦插苗用LKXQ 表示。

1.2 试验方法

1.2.1 干旱胁迫

2017 年8 月，选择生长健壮、枝叶均匀移栽后1.5年生幼苗进行水分胁迫处理，胁迫方式为土壤干旱渐进胁迫。每个蓝莓品种各选择长势较一致的移栽幼苗25 株进行胁迫处理。先对试验容器苗进行充分浇水3 d 后停止浇水，使其进行自然干旱，分别于停止浇水后第7 d、第14 d、第21 d、第28 d 随机选取植株功能叶片，测定叶片相对含水量、叶片相对电导率、叶绿素含量、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量，每次采样时对土壤进行含水量的测定，每个指标测定3 次重复。

1.2.2 叶片切片制作

在胁迫第7 d 和第28 d 分别选取“灿烂”“莱克西”2个蓝莓品种组培和扦插的1.5 年生苗作为试验材料，分别将采集的大小一致无病虫害、无机械损伤的叶片跨中脉截取0.5 cm×0.5 cm 作为材料，用FAA 固定液固定24 h以上，梯度酒精和二甲苯进行脱水和透明，进行常规石蜡切片制作，切片厚度8～10 μm，番红-固绿染色，树脂胶封片，Nikon eclipse-e200 显微镜下观察、随机选取30 个视野进行拍照测定。

1.3 指标测定

1）土壤含水量。采用土壤烘干法测定土壤含水量。

2）叶片相对电导率测定。参考陈文荣等的改进方法采用佑科DDS-307A 型电导率仪测定［8］，将待测叶片擦洗干净，每个样品称取0.1 g 放入用20 mL 去离子水，用注射器抽真空，摇床振荡3 h，静置1 h，测定初电导率及所用去离子水的电导空白，沸水浴15 min 杀死组织细胞，静置1 h，测终电导率。相对电导率的计算公式为（1）：

3）叶片相对含水量。取鲜叶称鲜叶质量，在蒸馏水中用注射器抽取真空，浸泡24 h 后称其饱和鲜样质量，之后在100～105 ℃下烘干，称其干样质量。相对含水量的计算公式为（2）：

4）叶绿素、丙二醛（MDA）及游离脯氨酸（Pro）含量。叶绿素含量采用丙酮乙醇1 ∶1 浸泡提取比色，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法，游离脯氨酸（Pro）采用酸性茚三酮法［9］。

1.4 数据处理

将试验数据采用Excel 2013 进行录入，采用spss 18.0 进行数据的处理，多重比较分析，单因素方差分析、隶属函数平均值法综合评价苗木抗旱性。

隶属函数平均值法中，若为正相关，则：

若为负相关，则：

式中：i表示某个品种；j表示某项指标；Uij表示i种类j指标的抗旱隶属函数值；Xij表示i种类j指标的测定值；Xjmin表示所有种类j指标的最小值；Xjmax表示所有种类j指标的最大值。

权重应用客观赋权法进行计算：

其中Ij是一个无量纲数，表示某评价指标在干旱胁迫下的测定值相对于对照组的比值。Cj是第j个指标正常组的测定值。Sj是第j个指标在某个胁迫处理下所测定的平均值。

如果是负相关，则计算式为Ij=Sj/Cj。最后通过归一化，计算出每个评价指标的权重：Wj=Ij/∑Ij。综合评价值：D=∑(Uij×Wj)。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下土壤含水量的变化

不同干旱处理时间土壤含水量变化如图1 所示。由图1 可知（小写字母代表显著性p＜0.05，下同），不同胁迫时间土壤相对含水量差异显著（p＜0.05）；处理第7 d，土壤含水量均值为84.72%±1.14%（正常生长），第28 d 的土壤含水量均值为24.78%±0.85%（重度干旱）。随着干旱胁迫的天数增加，土壤含水量下降显著，从第7 d 到第14 d 时下降最明显，整体下降33.30%。

图1 不同干旱处理时间土壤含水量变化

2.2 干旱胁迫下蓝莓叶片叶绿素含量的变化

不同干旱时间叶绿素含量变化如图2 所示。由图2可知，随着干旱胁迫增加，叶绿素含量逐渐降低。“莱克西”蓝莓在第14 d 叶绿素含量下降明显，扦插苗和组培苗比第7 d 分别下降了32.52%、51.14%；“莱克西”蓝莓组培苗从第14 d 后变幅很小，“莱克西”蓝莓扦插苗在干旱胁迫期间变幅最大，第28 d 叶绿素含量最小为（1.16±0.02）mg·g-1，比第7 d 下降了67.48%。“灿烂”蓝莓在第21 d 明显下降；“灿烂”蓝莓组培苗在后期变化缓慢，“灿烂”蓝莓扦插苗整体变化较明显。

图2 不同干旱时间叶绿素含量变化

2.3 干旱胁迫下蓝莓叶片丙二醛含量的变化

不同干旱时间叶片丙二醛（MDA）含量变化如图3所示，随着干旱程度的增加，丙二醛含量呈增加趋势。干旱前期，“莱克西”蓝莓和“灿烂”蓝莓中MDA 含量差异显著（p＜0.05），“莱克西”蓝莓中MDA 含量变幅较小，组培苗和扦插苗中MDA 含量的变幅分别仅为3.56%、7.78%；干旱后期，“灿烂”蓝莓中MDA 含量的变幅明显弱于“莱克西”蓝莓，组培苗和扦插苗的变幅分别为11.32%、5.43%。在干旱胁迫时MDA 含量相差最大的是“灿烂”蓝莓组培苗，为58.54 nmol·g-1，其次是“灿烂”蓝莓扦插苗，变化为44.89 nmol·g-1，“莱克西”蓝莓的扦插苗和组培苗变化差距不大，分别为42.07 nmol·g-1、42.88 nmol·g-1。

图3 不同干旱时间叶片MDA 含量变化

2.4 干旱胁迫下脯氨酸含量变化

不同干旱时间叶片脯氨酸含量变化如图4 所示。由图4 可知，随着干旱胁迫的增加，叶片脯氨酸含量逐渐增加，但增加幅度不一致。4 种类型的蓝莓苗初始和结束时的脯氨酸含量差异明显（p＜0.05），初始时脯氨酸含量“莱克西”蓝莓扦插苗最大，其次是“灿烂”蓝莓扦插苗，胁迫第28 d 时脯氨酸含量从大到小依次是“莱克西”蓝莓扦插苗、“莱克西”蓝莓组培苗、“灿烂”蓝莓扦插苗、“灿烂”蓝莓组培苗，且4 种幼苗脯氨酸差异显著（p＜0.05）。“莱克西”蓝莓扦插苗在第7 d 时含量最小，但是在第14 d 后脯氨酸含量均大于其他3 种幼苗，且第28 d 的含量是第7 d 的1.86 倍，说明“莱克西”蓝莓扦插苗对干旱胁迫反应强烈。

图4 不同干旱时间叶片脯氨酸含量变化

2.5 干旱胁迫下叶片相对含水量变化

不同干旱时间叶片相对含水量变化如图5 所示，随着水分胁迫程度的加强，蓝莓叶片的相对含水量逐渐降低。胁迫初期叶片相对含水量最大的是“莱克西”蓝莓组培苗，含量为82.80%，最小的是“灿烂”蓝莓组培苗，含量为70.18%。胁迫第21 d 以前叶片相对含水量4 种幼苗均变化幅度较小，第28 d 时变化幅度较大，变化幅度最大的是“莱克西”蓝莓扦插苗，最小的是“灿烂”蓝莓扦插苗。

图5 不同干旱时间叶片相对含水量变化

2.6 干旱胁迫下叶片相对电导率变化

干旱程度的加剧会造成植物的膜伤害，质膜透性增大，电导率值即可反映伤害程度，从而鉴定出植物的抗旱能力。随着干旱时间的增加叶片相对电导率呈上升趋势，如图6 所示。胁迫初期，“灿烂”蓝莓扦插苗和组培苗变幅明显，第14 d 叶片相对电导率分别比第7 d 上升了1.97 倍和1.31 倍；在胁迫后期，“莱克西”蓝莓扦插苗和组培苗相对电导率变化较明显，第28 d 比第21 d上升了61%和87%。可见，4 种蓝莓幼苗在不同胁迫时间受胁迫程度不一样。

图6 不同干旱时间叶片相对电导率变化

2.7 干旱胁迫下蓝莓抗旱性评价

隶属函数法是目前应用最广的多指标评价方法［10-11］，通过对4 种苗木各项理化指标进行隶属函数综合评价，由表1 可知，抗旱性由强到弱的是“灿烂”蓝莓组培苗、“莱克西”蓝莓组培苗、“莱克西”蓝莓扦插苗、“灿烂”蓝莓扦插苗。

表1 两种繁殖方式下两个品种抗旱性综合评价

2.8 干旱胁迫下蓝莓叶片结构变化

对干旱胁迫下蓝莓叶片进行石蜡切片比较，结果表明，“灿烂”蓝莓和“莱克西”蓝莓的组培苗的上表皮厚度值、栅栏组织厚度值、叶片厚度值、栅海比值均高于扦插苗，见表2。

表2 叶片结构指标

3 结论与讨论

随着干旱程度加深，不同繁殖方式下4 种蓝莓幼苗叶绿素含量、叶片相对含水量不断下降，丙二醛含量、脯氨酸含量、叶片相对电导率不断增加。在干旱胁迫下，幼苗在生理上首先表现为叶片水分亏缺；在生化方面水分胁迫导致活性氧等自由基积累，引起膜脂过氧化，膜脂过氧化产物MDA 含量和渗透调节物质脯氨酸含量增加，幼苗迅速启动保护酶系统和积累渗透调节物质；在结构上由于水分亏缺引起细胞脱水，导致细胞膜损伤，质膜相对透性增加［12-14］。本试验结果表明，4 种苗木在干旱胁迫下，土壤含水量降低，导致植株根系吸水困难，植株组织水分亏缺，叶片相对含水量降低，“莱克西”蓝莓扦插苗叶片相对含水量降低最明显，“灿烂”蓝莓组培苗的叶片相对含水量变化最小，叶片相对含水量变化小，说明“灿烂”蓝莓组培苗在干旱胁迫下能通过维持组织含水量来抵御干旱。此外，叶绿素含量是植物对干旱胁迫响应敏感的指标，大量的研究结果表明，干旱胁迫通过抑制叶绿素合成，并加速其分解，导致叶绿素含量直线下降［12,15］。本试验结果表明，干旱胁迫下叶绿素均显著下降，但在胁迫后期，“灿烂”蓝莓和“莱克西”蓝莓的组培苗均变化不明显，这种变化可能是植株在受到胁迫后引起膜脂过氧化产生MDA 和脯氨酸阻碍了叶绿素的合成。

植物器官的形态结构与植物生理功能密切相关，生理变化间接导致形态结构的变化，表皮是叶片结构的基础，植物解剖结构中表皮越厚，其抗旱、隔热、持水能力一般均较强，对于干旱逆境的抵抗力越强［16-17］。本试验中“灿烂”蓝莓和“莱克西”蓝莓两种苗木，均是扦插苗的上表皮厚度大于组培苗叶小而厚，栅栏组织发达，栅栏组织与海绵组织比值高，角质层及上皮层厚，叶肉细胞小而排列紧密，气孔下陷、表皮毛发达等都是抗旱性强的标志［18-21］。本试验中，从叶片厚度来看，“灿烂”蓝莓叶片厚度明显厚于“莱克西”蓝莓，一般认为叶片小而厚是植物抗旱的特征，细小的叶形可以减少水分蒸发的面积，叶片越厚，储水能力越强［22］。隶属函数的抗旱性综合评价得出的结果与此一致，但在植物抗旱性综合评价中不能用单一的指标进行评定，因为植物的抗旱性与植物本身的结构和外界环境有关，单一的指标评定很难反应客观结果，可采用多种指标综合评价［19］。