孙静 赵荣华 包蕾 郭姗姗 张广平 耿子涵 时宇静 宋玲 高云航 李晓璐 崔晓兰

摘要 目的：研究热毒宁注射液不同给药途径对幼龄小鼠副流感病毒肺炎的药理作用，为临床用药提供参考。方法：幼龄ICR小鼠按体质量等级随机分组，包括正常组、模型组、阳性对照组、热毒宁注射给药对照组，热毒宁雾化吸入给药20 min、10 min、5 min和2.5 min组。采用副流感病毒感染幼龄小鼠致肺炎模型，通过肺指数、肺指数抑制率、肺組织病毒载量、肺部病理评分等指标评价热毒宁注射液不同给药方式治疗幼龄小鼠副流感病毒肺炎的药理作用。结果：热毒宁雾化吸入给药4个剂量组均可不同程度降低小鼠肺指数及病毒载量，减轻肺组织病理损伤;其中雾化吸入给药20 min组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：热毒宁雾化吸入给药20 min对副流感病毒感染所致小鼠病毒性肺炎具有显著治疗作用，且优于注射给药组。

关键词 副流感病毒;肺炎;幼龄小鼠;热毒宁注射液;雾化吸入给药;病毒载量;给药方式;肺指数

Study on Pharmacological Effects of Reduning Injection with Different Administration Methods on Parainfluenza Virus Pneumonia in Immature Mice

SUN Jing1，ZHAO Ronghua1，BAO Lei1，GUO Shanshan1，ZHANG Guangping1，GENG Zihan1，SHI Yujing1，SONG Ling1，GAO Yunhang1，LI Xiaolu2，CUI Xiaolan1

（1 Biosafety Laboratory，Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 Department of Cardiology，Beijing Hospital，Beijing 100730，China）

Abstract Objective：To study the pharmacological effects of Reduning Injection on parainfluenza virus pneumonia by different means of administration in immature mice，and to provide the reference for clinical medication.Methods：Young ICR mice were randomly grouped according to body weight class，including a normal group，a model group，a positive control group，and a Reduning Injection administration control group.Reduning atomized inhalation administration 20 min，10 min，5 min and 2.5 min groups.The parainfluenza virus was used for infection model of pneumonia in young mice.The lung index，lung index inhibition rate，lung tissue viral load，lung pathology score and other indicators were used to evaluate pharmacological effects of the different administration methods of Reduning Injection in treating parainfluenza virus pneumonia in young mice.Results：All the 4 groups of Reduning aerosol inhalation administration could reduce the lung index，viral load，alleviate the pathological damage of lung tissue.Compared with the model control group，there were significant differences（P<0.05） between the aerosolized inhalation administration group for 20 min.Conclusion：Reduning aerosol inhalation administration for 20 minutes has a significant therapeutic effect on viral pneumonia in mice caused by parainfluenza virus infection，and is better than the injection administration group.

Keywords Parainfluenza virus; Pneumonia; Immature mice; Reduning Injection; Aerosol inhalation administration; Viral load; Administration methods; Lung index

中图分类号：R254文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.011

小儿副流感病毒肺炎是由人副流感病毒感染引起的肺部炎症，是人类呼吸道感染性疾病的重要病因之一，尤其在5岁以下儿童中易引起下呼吸道感染，致病性仅次于呼吸道合胞病毒。北方地区易发于冬、春寒冷季节，南方则夏、秋季多发，主要通过空气中的飞沫经呼吸道传播[1-2]。副流感病毒首次在日本仙台1名儿童死者体内分离，故又称仙台病毒，是一种单链RNA病毒，属副黏病毒属，一般呈球形，有包膜。在健康成年人中感染后症状较轻，可出现感冒和喉咙疼痛等症状，但由于儿童的免疫系统发育尚不完善，故感染后可引起严重的下呼吸道感染，如气管或支气管炎、肺炎，甚至伴有严重的并发症。目前尚无针对副流感病毒的疫苗或特异性治疗手段[3-4]。

热毒宁注射液组方包括青蒿、金银花和栀子3味中药，具有清热、疏风、解毒的功效，临床主要用于治疗外感风热所致的感冒、咳嗽及上呼吸道感染、急性支气管炎等，临床疗效确切[5-6]。本研究通过建立幼龄小鼠副流感病毒肺炎模型，评价热毒宁注射液雾化吸入及静脉注射2种给药方式对模型肺指数、病毒载量、肺间质病变及支气管病变的药理作用，为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取3～4周龄ICR小鼠，SPF级，体质量（14.00±1.00）g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。所有动物在2级生物安全实验室动物房内饲养，压力-20 Pa，温度20 ℃，相对湿度50%，动物自由进食饮水。实验中所有操作均遵循NIH及北京市实验动物伦理委员会的有关规定，经动物福利伦理委员会批准通过（伦理审批号：2017D008）。

1.1.2 药物 热毒宁注射液（江苏康缘药业股份有限公司，批号：170134）;利巴韦林颗粒（四川百利药业有限责任公司，批号：160622）。

1.1.3 试剂与仪器 One Step TB GreenTM PrimeScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ（TaKaRa公司，日本，批号：RR086A）;苏木精染色液（北京雷根生物技术有限公司，批号：0527A17）;伊红（北京化工厂，批号：20150915）;切片石蜡56～58 ℃（上海华永石蜡有限公司，批号：20170421）;A2型生物安全柜（Thermo公司，美国，型号：MSC1.8）;小动物口鼻暴露塔（DSI公司，美国，型号：Buxco）;实时荧光定量PCR仪（ABI公司，美国，型号：7500）。

1.1.4 毒株 人副流感病毒HPIV-3，购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将幼龄ICR小鼠按照体质量等级随机分为8组，包括正常组、模型组、阳性药对照组（利巴韦林）、热毒宁原途经对照组（注射给药），热毒宁雾化给药20 min、10 min、5 min、2.5 min不同剂量组。除正常组外，其余各组小鼠轻度麻醉后滴鼻感染人副流感病毒HPIV-3。

1.2.2 给药方法 感染当天热毒宁各剂量组分别雾化吸入给药20 min、10 min、5 min、2.5 min，热毒宁注射给药组尾静脉注射给药，0.1 mL/10 g，1次/d，连续4 d。于第5天称重后，小鼠脱颈椎处死，称量肺组织，按照以下公式计算肺指数及其抑制率。肺指数=小鼠肺重/小鼠体质量;肺指数抑制率=（模型组肺指数-给药组肺指数）/（模型组肺指数-正常组肺指数）×100%[7-8]。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 病毒载量检测（RT-PCR法） 小鼠肺组织称重后，取部分分装置于-80 ℃低温冰箱中保存;实验前将小鼠肺组织置于研钵，倒入少量液氮研磨成粉，每个样本加入1 mL Trizol Reagent，室温放置20 min后，4 ℃，6 000×g离心10 min，取上清加入0.2 mL氯仿室温孵育2～3 min，4 ℃，6 000×g离心15 min后，取上清加异丙醇，混匀，室温孵育30 min，4 ℃，6 000×g离心10 min，弃上清，75%乙醇洗沉淀，弃上清，通风橱内干燥5～10 min，DEPC水溶解沉淀，-80 ℃保存备用。小鼠GAPDH基因[9]：上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′;下游5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′;副流感病毒基因[10]：上游5′-GGGCGGCATCTGTAGAAATC-3′;下游5′-CGGAAATCAC GAGGGATGG-3′。

1.2.3.2 肺組织病理学检测 小鼠肺组织称重后，固定于10%甲醛溶液中，3 d后取出进行取材。横切肺左叶含左主支气管一块，厚度为3～5 mm。将组织块脱水、透明化后，浸蜡包埋，切成厚度约为3 μm的石蜡切片，采用苏木精及伊红染色，置于光学显微镜下观察，按照表1中的分级标准进行评分。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对研究数据进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 热毒宁不同给药途径对副流感病毒肺炎小鼠肺指数的影响 副流感病毒HPIV-3感染可引起小鼠肺指数显著升高，热毒宁雾化吸入给药的4个剂量组均能在一定程度上降低人副流感病毒HPIV-3感染后小鼠肺指数，其中雾化吸入20 min组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），肺指数抑制率为45.05%;热毒宁雾化吸入给药的4个剂量组的肺指数抑制率呈现出一定的量效关系。热毒宁静脉注射组一定程度上可降低小鼠肺指数，但与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），且抑制率低于雾化吸入各剂量组。见表2。

2.2 热毒宁不同给药途径对副流感病毒肺炎小鼠肺组织中病毒载量的影响 PCR结果显示，模型组小鼠肺组织中副流感病毒载量显著升高，热毒宁雾化给药的4个剂量组均能够在一定程度上降低小鼠肺组织中副流感病毒载量，其中高剂量组病毒载量与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.01），病毒载量抑制率是34.57%，热毒宁静脉给药组作用不显著。见表3。

2.3 对副流感病毒肺炎小鼠病理变化的影响 镜下观察模型对照组小鼠肺组织病理变化以间质性肺炎为主，表现为小支气管和小静脉周围淋巴细胞、中性粒细胞和大单核细胞浸润，肺泡壁肿胀、变性、塌陷，肺泡腔扩大变圆。小支气管上皮细胞变性坏死，上皮细胞脱落，严重者可见支气管腔内中性粒细胞、支气管上皮细胞、纤维素、黏液和坏死崩解的细胞碎片;热毒宁雾化吸入不同时间组均可不同程度减轻人副流感病毒HPIV-3感染所致小鼠肺间质病变及支气管病变，其中雾化吸入20 min组肺间质病变评分与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）;雾化吸入20 min、10 min、5 min组支气管病变评分与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;热毒宁静脉注射组可显著减轻肺组织支气管病变，但对肺间质病变无显著作用。雾化吸入20 min组改善副流感病毒肺炎肺组织病理损伤总体作用优于注射给药组。见表4、表5及图1。

3 讨论

雾化吸入疗法是用雾化装置将药物分散成微小的雾滴或微粒，使其悬浮于气体中，进入呼吸道及肺部而发挥局部或全身治疗作用。由于肺组织血流量大，毛细血管丰富，肺部给药后药物吸收迅速，故雾化吸入给药具有起效快、用量少、局部药物浓度高，而全身不良反应少等优点，且其成本低，使用方便，适用于儿童、老人及重症患者等，广泛用于呼吸、血液、神经、运动、内分泌等系统的疾病治疗中，疗效显著[11-12]。中药雾化吸入疗法在临床上广泛应用于治疗肺炎、支气管炎等呼吸道疾病，相比于注射给药，其给药方式更便捷，安全性更高，且疗效明显优于静脉注射[13-16]。在临床治疗中，雾化吸入给药途径已成为治疗儿童呼吸道疾病的常用方法。

热毒宁注射液由青蒿、金银花和栀子3味中药组成，方中以青蒿为君药，发挥清热凉血、透散肌表之功效;金银花为臣药，擅清热解毒、透散表邪;佐药栀子，具有解毒、清热、凉血、清泄心肺胃之功效。该药在儿科临床应用中常采用雾化吸入给药途径，用于治疗小儿病毒性肺炎、小儿手足口病、小儿急性支气管炎等，已取得较好的临床疗效[17-20]。本研究结果显示，热毒宁雾化吸入给药20 min可显著降低小鼠肺指数及肺组织中病毒载量，显著改善肺间质病变及支气管病变，且总体疗效优于静脉注射给药组。

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（2020-11-20收稿 责任编辑：吴珊）