王盟 毕倩宇 李慧 吕传峰

摘要 目的：观察钩藤碱固体脂质纳米粒（Rhy-SLN）对小鼠气道平滑肌细胞（ASMC）的增殖细胞核抗原（PCNA）表达以及TGF-β1/Smad信号通路的影响。方法：将小鼠ASMC体外分离培养，用Rhy-SLN干预ASMC，用免疫荧光法测定小鼠ASMC的PCNA的表达;Western Blotting法检测小鼠ASMC中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达。结果：Rhy-SLN在一定程度上可以降低小鼠气道平滑肌细胞中PCNA的表达1.80±0.12比1.50±0.15（P<0.05），显著下调Smad2蛋白1.09±0.20、p-Smad2蛋白1.97±0.70、p-Smad3蛋白4.47±0.35、p-Smad4蛋白1.42±0.20相对表达（P<0.05），显著上调Smad7蛋白0.65±0.15相对表达（P<0.05），效果与通路阻滞剂SB431542组相似。结论：Rhy-SLN可以抑制小鼠ASMC的增殖，其机制可能与调节TGF-β1诱导的Smad信号通路有关。

关键词 钩藤碱;固体脂质纳米粒;哮喘;支气管平滑肌细胞;增殖细胞核抗原;转化生长因子-β1

Effects of Rhynchophylline Solid Lipid Nanoparticles on Proliferation and TGF-β1/Smad Pathway in Airway Smooth Muscle Cells of Mice

WANG Meng1，2， BI Qianyu2， LI Hui1， LYU Chuanfeng1

（1 Jining NO.1 People′s Hospital， Jining 272000， China; 2 College of Chinese Traditional Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）

Abstract Objective：To observe the effect of Rhy-SLN on the expression of PCNA and TGF-β1/Smad signal pathway of ASMC in mice. Methods：Mouse ASMC were isolated and cultured in vitro， Rhy-SLN interfered with ASMC， and the expression of PCNA in mouse ASMC was determined by immunofluorescence method; the expression of Smad2， p-Smad2， Smad3， p-smad3， Smad4， Smad7 in ASMC was detected by Western blot. Results：To a certain extent， Rhy-SLN can reduce the expression of PCNA in airway smooth muscle cells of mice [（1.80±0.12） VS （1.50±0.15）] （P<0.05）， significantly down regulate the relative expression of Smad2 （1.09±0.20）， p-Smad2（1.97±0.70）， p-Smad3（4.47±0.35）， p-Smad4（1.42±0.20） protein （P<0.05）， significantly up regulate the relative expression of Smad7 （0.65±0.15） protein （P<0.05）， the effect was similar to that of SB431542. Conclusion：Rhy-SLN can inhibit the proliferation of ASMC in mice， and its mechanism may be related to the regulation of Smad signal pathway induced by TGF-β1.

Keywords Rhynchophylline; Solid lipid nanoparticles; Asthma; Airway smooth muscle cell; Proliferating cell nuclear antigen; TGF-β1

中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.010

支气管哮喘涉及多种细胞及其组分，以可逆性的气流阻塞和气道的高反应为特征的慢性炎症疾病，其炎症反应的不断发展刺激气道平滑肌细胞（Airway Smooth Muscle Cell，ASMC）的增殖及肥大[1]。因此如何抑制AMSC的增殖，进而抑制气道重塑的过程，已经成为了治疗哮喘疾病新的研究方向。

钩藤碱为中药钩藤的重要有效成分之一，具有抗高血压、抗心肌缺血、抗心肌重构等一系列药理作用[2-6]。前期研究表明，钩藤碱固体脂质纳米粒（Rhynchophylline-loaded Solid Lipid Nanoparticles，Rhy-SLN）可以缓解小鼠的哮喘反应，降低支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症介质IL-4、IL-5、IL-13、嗜酸性粒细胞以及血清中IgE的水平，并且可以降低小鼠肺组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4的蛋白水平[7]。为进一步明确Rhy-SLN缓解小鼠哮喘的分子作用机制，本实验通过Rhy-SLN对小鼠气道平滑肌细胞PCNA表达的影响以及对TGF-β1/Samd信号通路的影响，为钩藤碱缓解支气管哮喘提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 BALB/c雌性小鼠24只，8周龄，体质量18～24 g，由济宁医学院动物中心提供，动物合格证号：20030011。伦理批号：2021伦审研第（032）号。动物饲养条件：动物饲养温度20～23 ℃，相对湿度40%～70%，动物自由进食饮水，昼夜节律正常[8]。

1.1.2 药物 钩藤碱固体脂质纳米粒（济宁市第一人民医院药学部自制，批号：20161114）。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM培养基（Gibco公司，美国，批号：12100-46）;TGF-β1（USCN公司，批号：RPA124Mu01）;PCNA（Proteintech公司，美国，批号：10205-2-AP）;钩藤碱（阿拉丁公司，批号：R102720）;TGF-β1抗体（博斯特生物公司，批号：BA0290）;Smad2抗体（Cell Signaling公司，美国，批号：5339）、Smad3（Cell Signaling公司，美国，批号：9523）、细胞外蛋白调节激酶ERK（Cell Signaling公司，美国，批号：4695）;Smad4抗体（上海生工生物工程公司，批号：D120124）、Smad7（上海生工生物工程公司，批号：D160746）、p38（上海生工生物工程公司，批号：D151619）;SB431542（阿拉丁公司，批号：S125924）;倒置相差显微镜（麦克奥迪公司，型号：AE31）;CO2培养箱（上海力申，型号：HF-90）;凝胶成像分析系统（BIO-RAD公司，美国，型号：AV-1000）;酶标仪（BIOTEK公司，美国，型号：ELx800）;荧光显微镜（OLYMPUS，日本，型号：IXplore SpinSR）。

1.2 方法

1.2.1 Rhy-SLN的制备 按照处方量精密称取钩藤碱、脂质、卵磷脂，采用纳米乳法制备钩藤碱固体脂质纳米粒，4 ℃条件下密封保存备用[9]。

1.2.2 ASMC的培养及传代 取5周龄的小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠处死，无菌条件下取出支气管组织，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，将支气管剪碎，加入0.1%胶原酶和0.1%胰蛋白酶的混合消化液，转移至15 mL离心管中，放入37 ℃水浴锅中进行水浴消化20 min。用含双抗的DMEM冲洗100目滤网，过滤消化混合液至15 mL离心管中离心。离心后弃上清液，细胞用完全培养基重悬，接种至12孔培养板中，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。当细胞密度达到90%时，将培养板中培养基上清液弃去，PBS清洗2遍后弃去。加入一定体积的胰酶消化细胞，待细胞变圆加入一定量的完全培养基终止消化。

1.2.3 分组与给药 收集4～6代小鼠ASMC，分为4个组，空白组，健康ASMC;TGF-β1组，加入5 ng/mL TGF-β1处理24 h;Rhy-SLN组，加入5 ng/mL TGF-β1及10 μmol/L Rhy-SLN处理24 h;SB431542组，加入5 ng/mL TGF-β1及10 μmol/L SB431542作用24 h。TGF-β1组、Rhy-SLN组和SB431542组在加药前，使用0.2% BSA/DMEM serum-free的培养基培养ASMC使细胞增殖停滞。

1.2.4 免疫荧光检测ASMC中PCNA的表达 取ASMC，去掉培养液，PBS冲洗，加4%多聚甲醛固定液固定15 min，清除4%多聚甲醛，PBS清洗3次，滴加0.1%tritonX-100至完全覆盖细胞，室温孵育30 min，PBS清洗3次，0.5%牛血清清蛋白封闭30 min。滴加一定量的山羊血清完全覆盖细胞，室温15 min。一抗用PBS按1∶50稀释，滴加到完全覆盖细胞，在4 ℃条件下过夜孵育。清除一抗，PBS清洗3次。滴加荧光二抗，稀释比例为1∶200，滴加到完全覆盖细胞，在室温下孵育60 min。清除二抗，PBS清洗3次。滴加DAPI到完全覆盖细胞复染细胞核。清除DAPI，PBS清洗3次。滴加抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察并进行拍照。

1.2.5 Western Blotting法检测ASMC中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7水平 取对数生长期的小鼠ASMC以2.0×105/孔接种于6孔板中，加入适量RIPA裂解液匀浆至充分裂解，BCA法进行蛋白定量得出上样量。取20 μg的蛋白加样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），随后开始电转，转印后的PVDF膜加入5%的脱脂奶粉TBST封闭1 h。将膜置于1∶1 000稀释的相应一抗中，4 ℃冰箱过夜。PBS洗涤后，将膜放入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG二抗（1∶2 000）孵育1 h。加入ECL化学发光试剂，室温条件下反应1～2 min，使用凝胶成像分析系统分析蛋白含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件对研究数据进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。多组间两两比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASMC的鉴定 ASMC成长条形或者梭形，呈典型的峰谷状生长。对平滑肌细胞特异的α-肌动蛋白免疫荧光染色阳性。见图1～2。

2.2 Rhy-SLN对TGF-β1诱导的ASMC中PCNA表达的影响 与空白组比较，TGF-β1组、Rhy-SLN组、SB431542组细胞PCNA蛋白的表达有显著上调（P<0.05），与TGF-β1细胞组比较，Rhy-SLN与SB431542组细胞PCNA蛋白的表达有显著下调（P<0.05）。见表1和见图3。

2.3 Western Blotting法檢测ASMC中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7的表达 与空白组比较，TGF-β1能显著上调Samd信号通路中Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相对表达，显著下调Smad7蛋白相对表达（P<0.05）;与TGF-β1组比较，Rhy-SLN与SB431542组显著下调Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相对表达，显著上调Smad7蛋白相对表达（P<0.05）。见表2～4和见图4。

3 讨论

钩藤是我国传统中草药，钩藤碱是钩藤中含量最大的生物碱成分，具有降低血压、抗血栓、抗血小板聚集等功效[10-11]。在前期的实验中将钩藤碱制成固体脂质纳米粒，并进行了药效和部分机制的动物体内实验，发现钩藤碱固体脂质纳米粒在一定程度上可以缓解小鼠的哮喘反应，降低支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、嗜酸性粒细胞含量以及血清中IgE的水平，還可以降低小鼠肺组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4的蛋白水平[3]。

哮喘是一种以气道慢性炎症和支气管平滑肌细胞异常增殖为病理特征的常见疾病[12-13]。增殖细胞核抗原（PCNA）主要表达于细胞的增殖期，与细胞的分裂增殖有着密切的关系，常作为评价细胞增殖状态的标志物[14-16]。本研究结果显示，钩藤碱固体脂质纳米粒在一定程度上可以降低小鼠气道平滑肌细胞中PCNA蛋白的表达，说明钩藤碱固体脂质纳米粒可以抑制平滑肌细胞的增殖。

转化生长因子β（TGF-β）有3种亚型，其中TGF-β1在哮喘发生演变的过程中起着重要的作用。Smads蛋白家族是TGF-β1信号转导通路中一个重要的基因家族，它受到激活后再将TGF-β1的信号从细胞表面的受体传到细胞核的过程中起着重要作用。Smads蛋白家族有9种Smad蛋白，其中Smad2、Smad3为受体调节性蛋白，可以被磷酸化;Smad4为共同调节性蛋白，Smad7为抑制性蛋白，不可以被磷酸化[17-20]。为进一步探讨钩藤碱固体脂质纳米粒缓解哮喘的作用机制，本研究利用钩藤碱固体脂质纳米粒作用于小鼠气道平滑肌细胞，检测TGF-β1诱导的Smads蛋白表达的变化情况。结果显示，钩藤碱固体脂质纳米粒显著下调Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相对表达，显著上调Smad7蛋白相对表达，效果与通路阻滞剂SB431542组相似，说明钩藤碱固体脂质纳米粒可以调控TGF-β1/Smad通路。

综上所述，钩藤碱固体脂质纳米粒在一定程度上可以调控TGF-β1/Smad信号通路，进而抑制小鼠气道平滑肌细胞的增殖，从而发挥缓解哮喘的作用，为进一步深入研究钩藤碱固体脂质纳米粒缓解哮喘的作用机制以及探寻哮喘治疗新靶点提供了一定基础。

参考文献

[1]王金磊，李承德，孙宏伟，等.黄芪多糖抑制NF-κB/MAPK信号通路和改善哮喘大鼠气道炎症的作用[J].中国药理学通报，2016，32（4）：489-493.

[2]崔莹.钩藤化学成分和药理活性研究进展[J].西安文理学院学报：自然科学版，2015，18（4）：16-18.

[3]延沁儒，王春梅.异钩藤碱保护神经系统的药理研究进展[J].遵义医学院学报，2018，41（3）：371-375.

[4]杨秀娟，洪燕龙，吴飞，等.HPLC测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的方法学探讨[J].中国中药杂志，2013，38（5）：720-724.

[5]田丽娜，高华武，龙子江，等.钩藤碱对自发性高血压大鼠的降压作用及其对血管的调节机制探讨[J].中草药，2014，45（15）：2210-2213.

[6]刘叶玲，王中师，张许.钩藤总碱对高血压动脉压力感受反射和对高血压靶器官的作用[J].医药导报，2015，34（9）：1155-1157.

[7]王盟，毕倩宇，季旭明.钩藤碱固体脂质纳米粒缓解小鼠哮喘作用及对TGF-β1/Smad/MAPK通路的影响[J].中华中医药杂志，2019，34（10）：4531-4535.

[8]王丹，曹思硕，康桦，等.银杏苁蓉配方急性毒性和亚慢性毒性实验研究[J].西北药学杂志，2016，31（6）：599-604.

[9]王盟，赵亚鑫，国伟，等.钩藤碱固体脂质纳米粒对TGF-β1诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响[J].国际中医中药杂志，2018，40（3）：231-235.

[10]李厚忠，王慧，黄伟，等.中药川贝对哮喘模型小鼠气道重塑及TGF-β1/Smad信号通路的影响[J].中国医院药学杂志，2018，38（6）：604-609.

[11]李汝鑫，程锦堂，焦梦娇，等.钩藤叶化学成分研究[J].中草药，2017，48（8）：1499-1505.

[12]张玉英，惠朋利，何云义，等.姜辛夏颗粒对哮喘大鼠气道重建TGF-β1表达的影响[J].时珍国医国药，2012，23（8）：1941-1943.

[13]潘亦林，朱燕亭，李满祥.支气管哮喘气道重塑的研究进展[J].中华肺部疾病杂志（连续型电子期刊），2015，8（6）：97-100.

[14]蔡艳，杨旭东，雷莹.TNF-α和IL-1β通过MAPK通路上调人支气管平滑肌细胞的缓激肽受体和内皮素受体[J].西北药学杂志，2018，33（3）：353-359.

[15]陈阳，陆杰，朱思敏，等.基于高通量测序技术研究葛根芩连汤及其配伍对急性肠炎大鼠肠道菌群多样性的影响[J].中国中药杂志，2020，45（6）：1406-1417.

[16]卫智权，阎莉，邓家刚，等.芒果苷对脂多糖诱导的慢性炎症大鼠MAPK通路及血清细胞因子的影响[J].中草药，2013，44（1）：52-58.

[17]孙丽，冯铁为.贝丹益肺胶囊对肺纤维化大鼠肺组织TGFβ-Smads表达的影响[J].中医药学报，2014，42（4）：76-78.

[18]杨帆，易桂生.小青龙汤对哮喘大鼠TGF-β1/Smad3信号通路的影响[J].河南中医，2014，34（6）：1041-1043.

[19]张翔，李文涛，段宝忠，等.基于品质特征的贝母类药材品种分类研究[J].中草药，2018，49（9）：2140-2146.

[20]刘碧源，申可佳，申奏秦旋，等.护卵汤对慢性应激超排卵小鼠卵巢TGF-β/Smads信号通路蛋白的影响[J].中华中医药杂志，2018，33（8）：3332-3335.

（2020-07-01收稿 责任编辑：杨觉雄）