彭禹铭 刘巳齐 李婧婧 纪可欣 李岑 刘艳霞

摘 要：从复合水果酵素中分离酵母菌，通过形态学特征，生理生化指标进行鉴定，并对其生长特性进行研究，结果表明：分离出的A1、A2、A3为水果酵素中的优势酵母，其具有耐高糖，耐低pH、耐高渗、耐一定酒精浓度特性，其可在初始糖量400g/L以下，pH为2以上，酒精浓度12%以下的环境中生长。

关键词：酵素;酵母;分离;生理生化特性;

1 前言

酵素食品是指新鲜果蔬、谷物、菌菇或其它食用植物等为原料，经微生物发酵形成的，富含维生素、酶、多酚类化合物等多种生物活性物质的产品[1]。其在维持机体代谢，促消化、修复组织，抗氧化、减肥，净化血等方面具有不可代替的功效[2-4]。

酵素生产主要是自然发酵过程，在其发酵过程中会产生多种酶类、短链脂肪酸、醇、酯等代谢产物。

自然发酵过程中微生物主要来源于原料本身和加工环境，其中部分微生物会快速生长并成为优势菌，例如乳杆菌、等细菌和毕赤酵母、少见的伊萨酵母和酿酒酵母等。

2 试验材料与方法

2.1 材料

复合水果酵素原液：发酵3个月，还原糖含量620g/L，pH3.25，硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、氯化钠、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖;PDA培养基、YEPD培养基、碳源基础培养基、氮源基础培养基、无维生素培养基。

2.2 实验方法

2.2.1 工艺流程

果肉→破碎→调配混合→发酵→成品→酵母培养→酵母分离纯化。

2.2.2 酵母菌的分离纯化

用梯度稀释法，将样品涂布于PDA培养基上进行分离纯化，纯化后转接于斜面保存待用。

2.2.3 形态特征鉴定

菌落形态观察：将纯化好的单菌落接种于PDA固体培养基和PDA液体培养基，于28℃恒温培养72h，记录菌落大小、形状、颜色、质地是否有凹凸。

显微观察：挑取少许单菌落于载玻片上，用灭菌生理盐水稀释，加盖玻片，于显微镜下观察记录细胞形态、菌体大小、形状、 繁殖方式。

2.2.4 生理生化特征鉴定

依据《酵母菌的特征及鉴定手册》和《微生物学实验手册》进行：糖发酵鉴定、碳源同化实验、氮源同化实验、无维生素培养基上生长实验、耐高渗透压的测试、产生类淀粉化合物测定等试验。

2.2.5 耐受性实验

2.2.5.1 生物量-吸光度标准曲线的绘制

将纯化好的单菌落接种于YEPD液体培养基，于28℃恒温培养1d，制成107CFU/mL的菌悬液。

取1mL活化好的菌液，接种于起始葡萄糖浓度为100g/L的YEPD液体培养基，于28℃下恒温培养2d。

分别取5、10、15、20、25、30、35mL，于50mL的离心管中，5000r/min离心10min，倾去上清液，将得到的2组菌体沉淀中的一组烘干、称重，另一组用去离子水定容到50mL容量瓶中，测定D600，绘制生物质干重-吸光度的标准曲线。

2.2.5.2 高糖耐受性实验

按3%的接种量，分别接种于起始葡萄糖浓度为100、200、300、400、500g/L的YEPD液体培养基，pH5.0，于28℃下恒温培养5d，OD600条件下每12h测定一次，重复3次。

2.2.5.3 低pH耐受性实验

配置pH为1、2、3、4、5、6的YEPD液体培养基，按3%的接种量接种，于28℃下恒温培养8d，每24h取一次样，测定OD600。

2.2.5.4 酒精耐受性实验

配置乙醇浓度为0、6%、9%、12%、15%、18%的YEPD液体培养基，按3%的接种量接种，于28℃下恒温培养8d，每24h取一次样，测定OD600。

3 结果与分析

3.1 分离纯化、形态及培养特征观察

筛选具有典型酵母菌落特征的菌落3株供试菌在固体、液体培养基上的菌落形态见表3-1。

3.2 菌株鉴定结果

菌株生理生化特征见表3-2，初步判断三株菌株属于接合酵母属。

3.3 耐受性考察（选取A1菌株进行耐受性实验）

3.3.1 生物量-吸光度标准曲线

菌悬液稀释成0.1g/L，0.15g/L，0.2g/L，0.25g/L，0.3g/L，0.35g/L的浓度，在波长600nm处测吸光度，绘制出生物量—吸光度标准曲线如下：

3.3.2 高糖耐受性考察

每隔12h，吸取一次菌悬液，在600nm处测其吸光度，根据标准曲线得出其每个时间段菌悬液的浓度。实验结果见图3-2。

由图3-2可知，在初始葡萄糖含量100～500g/L时，随着初始葡萄糖含量的增加，菌株生长延缓期增长，当初始糖浓度为600g/L时，菌株延缓期84h，且生长极其缓慢。

3.3.3 低pH耐受性考察

每隔12h，吸一次菌悬液，600nm处测吸光度，结果见图3-3。

由图3-3可知，当初始pH为1和2时，菌株不生长，当初始pH为3-6时，菌株的延缓期逐渐缩短。

3.3.4 酒精耐受性考察

每隔12h取一次菌悬液，在600nm处测其吸光度，结果见图3-4。

由图3-4可知，初始乙醇浓度为15%和18%时，菌株不生长，而在0%～12%区间时，菌株的延缓期逐渐延长。

4 结论

从发酵3个月的复合水果酵素原液中分离出A1、A2、A3等三株菌株，均被鉴定为接合酵母，该菌种在初始葡萄糖含量100～400g/L时，均可生长，随着初始葡萄糖含量增加，菌种的延缓期增长。在初始pH为3～6时，随着初始pH的增加，菌株生长的延缓期变短。在初始乙醇浓度为0%～12%时，随着初始乙醇浓度的增加，菌株生长的延缓期增长。

參考文献

[1] 中国生物发酵产业协会.T/CBFIA 08001-2016，酵素产品分类导则[S].北京：中国标准出版社，2016.

[2] 毛建卫，吴元锋，方晟.微生物酵素研究进展[J].发酵科技通讯，2010，39（3）：42-44.

[3] 蒋增良.天然微生物酵素发酵机理、代谢过程及生物活性研究[D].宁波：浙江理工大学，2012：1-6.

[4] 蒋增良，毛建卫，黄俊，等.蓝莓酵素在天然发酵过程中抗氧化性能的变化[J].食品工业科技，2013，34（2）：194-197.

[5] [英]巴尼特（Barnett，J.A.）著，胡瑞卿 译.《酵母菌的特征及鉴定手册》[M].青岛海洋大学出版社.2015.

[6] 刘雅婷，王建斌.《微生物学实验手册》[M].中国农业出版社，2013.