李 杰，李小娟，肖友伦，任佐华，邓力喜，夏新格，朱 艳，刘二明*

(1. 湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省植物保护研究所，湖南 长沙 410125；3.遵义师范学院生物与农业科技学院，贵州 遵义 563006; 4. 湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128)

【研究意义】稻瘟病菌[Magnaportheoryzae(Hebert)Barr]无性态为Pyriculariaoryzae(Cook)Sacc，是稻梨孢属真菌，由其引起的水稻稻瘟病是我国水稻三大病害之一，一般可引起水稻减产10%～30%，严重的可达50%以上甚至绝收[1]。据报道，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失高达1000万t以上，经济损失达数百亿美元[2]；近年我国稻瘟病的年均危害面积在7500万 hm2左右[1]。实践证明，在众多的防治措施中，选育和利用抗病品种是控制该病害最经济、安全和有效的措施[1-2]，而抗瘟性鉴定评价则是开展抗病育种研究的重要环节。迄今为止，在稻瘟病选择压力大、病菌群体遗传组成丰富的病圃中进行自然诱发仍是最有效、最可靠和最经济的抗瘟性鉴定评价方法[3]。然而，由于水稻稻瘟病菌生理小种的多样性和易变性，大部分水稻品种在推广种植3～5年之后抗性下降甚至丧失[4]。因此，开展病圃稻瘟病菌生理小种的鉴定研究，有针对性地筛选稻瘟病抗源与抗性品种，进而加快稻瘟病抗性品种的培育与合理利用进程，对稻瘟病的可持续防治具有重要意义。【前人研究进展】为客观反映各稻区稻瘟病的实际发生情况与对抗病育种进行科学指导，通常要在同一稻区不同生态区域的稻瘟病常发或重发区设立多个自然诱发病圃，并利用7个中国鉴别品种测定病圃内的稻瘟病菌生理小种组成情况。如广东省至今设立了3个代表性病圃[5]，湖南省也设立了3个代表性病圃对区试品种进行抗瘟性鉴定[6-8]，广西、湖北、云南、贵州等地的情况也类似[9-12]。广东省3个稻瘟病圃分别设址于阳江、龙川及从化吕田，姜先芽等[13]研究表明阳江病圃稻瘟病菌的优势生理小种为ZC13，其次为ZB13；康金平等[14]研究显示龙川病圃稻瘟病菌的优势生理小种为ZB13,其次是ZC13；杨建源等[5]研究发现，从化吕田病圃稻瘟病菌的优势生理小种为ZB13，其次是ZB5、ZC13；这揭示，广东3个病圃的优势生理小种较为一致，而钟宝玉等[15]研究发现广东省的优势生理小种也为ZB13，表明这3个病圃的小种类型在广东省具有代表性。湖南省3个稻瘟病圃分别设址于桃江、浏阳、凤凰，其中桃江病圃位于湖南省益阳市桃江县高桥乡罗溪村，长期是长江中下游稻区和湖南省水稻新品种区试的稻瘟病抗性鉴定基地。近年来，虞选杰等[16]、毛锐等[17]、周瑚等[18]先后研究了桃江稻瘟病圃病菌的遗传多样性情况，均显示该病圃稻瘟病菌群体的遗传差异大、遗传结构复杂，但未对病菌的生理小种类型进行鉴定。【本研究切入点】桃江病圃稻瘟病菌群体遗传多样性丰富、优势小种在湖南省具有代表性，但近10年来未对桃江病圃稻瘟病菌的生理小种组成与毒性进行过研究。【拟解决的关键问题】通过在番茄燕麦培养基上诱导产孢测定64个分离菌株的产孢能力，利用离体接种鉴定技术并基于接种菌株在7个中国鉴别品种上的抗感反应，分析桃江病圃稻瘟病菌群体的生理小种类型与毒性，旨在为湖南省乃至长江中下游地区抗稻瘟病品种选育与利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试鉴别品种 7个中国鉴别品种分别为特特普、珍珑13、四丰43、东农363、关东51、合江18、丽江新团黑谷，均由湖南省农科院植物保护研究所繁殖并提供。

1.1.2 供试稻瘟病菌 2018年在桃江病圃(湖南省益阳市桃江县高桥乡罗溪村)采集稻瘟病穗颈瘟标样100份，通过单孢分离法获得稻瘟病菌64个，菌株名录及来源水稻品种(系)名称详见表1。

1.1.3 培养基 水琼脂培养基(Water agar medium)：琼脂30 g，加水定容至1 L，灭菌。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar medium)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，加水定容至1 L，灭菌。

番茄燕麦培养基(OTA medium)：燕麦片40 g(煮沸过滤)，番茄汁150 mL，琼脂18 g，pH 6.5～6.7，加水定容至1 L，灭菌。

1.2 鉴定方法

1.2.1 菌株产孢 将分离获得的64个稻瘟病菌接种到番茄燕麦培养基上(培养皿直径6 cm)进行活化，待菌丝长满后，加入2 mL水，用棉签轻刮下培养基表面的菌丝并打散；再用1 mL移液枪将菌丝液转移至新的番茄燕麦培养基上(培养皿直径6 cm)，灭菌玻璃棒涂布均匀，于超净工作台上吹干后，放入培养箱中28 ℃黑暗培养2～3 d；然后用棉签将培养基表面菌丝轻擦去，置于光照培养箱中28 ℃蓝黑光照培养3～4 d，即可获得大量分生孢子。每皿加2 mL无菌水洗下孢子，显微镜下用血球计数板统计孢子数量，测定菌株的产孢能力。

1.2.2 菌株生理小种鉴定 (1)播种与育苗。供试鉴别品种预先在室温下进行催芽，露白后播种于塑料育秧盆中，每品种30粒左右。育苗土为田间土壤，秧苗接种前5～7 d施用一次尿素。

(2)制备孢子悬浮液。分离的稻瘟病菌株在番茄燕麦培养基上诱导产孢完成后，先加2 mL无菌水于培养皿中，再用油画笔洗下分生孢子，最后将孢子浓度调至1×105个/mL接种备用。

(3)离体叶片划伤接种。待水稻秧苗长至4叶期时，参照并改良张海旺等[19]方法进行水稻离体叶片划伤接种。先用消过毒的剪刀将其叶子剪成4 cm左右叶段，再用枪头垂直主叶脉处制造2个微创伤口但不穿透叶片；将叶片放入预先加有6-BA溶液的培养皿(直径9 cm)中，把10 μL孢子液滴在叶片伤口上；然后将接种后的培养皿置于28 ℃黑暗条件下放置24 h，最后在28 ℃光照/黑暗交替条件下放置5～7 d，感病品种丽江新团黑谷充分发病后调查记录抗感反应类型。每处理3次重复。

(4)确定稻瘟病菌生理小种类型。根据张海旺等[19]离体叶片接种采用的标准进行调查：叶片划伤处呈褐色点状病斑，记为“R”；病斑呈梭形，最外层是淡黄色的中毒部，形状不规则，记为“S”。记载鉴别品种的抗(R)感(S)反应类型，参照全国稻瘟病生理小种联合试验组(1980)的标准[20]进行病菌生理小种分类和毒性分析。

1.2.3 病圃自然诱发鉴定 称取7个中国鉴别品种的种子各10 g，经浸种、催芽于2018年5月21日播种于湖南桃江病圃中，秧箱两边播种鉴别品种，中间播种诱发品种湘晚籼11号，当苗龄在4～6叶期时调查，具体调查方法与分级标准参照文献[6]执行，当诱发品种发病在7级以上时，调查7个中国鉴别品种的发病情况，0～4级为“R”反应，5～9级为“S”反应。

1.3 统计分析

采用Excel2013软件，分别对不同分离菌株的产孢数量进行平均值与标准差分析，根据在7个鉴别品种上的抗感反应进行生理小种类型划分，在此基础上统计各生理小种出现的频率并作出柱形图。

2 结果与分析

2.1 桃江病圃稻瘟病菌的产孢能力分析

通过在OTA培养基上培养与蓝黑光灯诱导产孢，孢子洗脱后利用血球计数板统计孢子数量(表2)，9-1-1、17-1-1、17-1-6、20-1-1、20-2-1、31-1-1、X7-1-16、X7-1-2、X7-1-3等9个菌株产孢能力最强，孢子数量在100×104个/mL以上；其次是6-1-1、6-2-1、9-2-1、31-1-3、31-2-1、33-1-2、35-2-2、S3-4-1、X1-1-8等9个菌株，产孢数量达50～100×104个/mL；而1-2-1、2-1-1、3-1-6、7-1-6、7-1-6、8-1-1、8-2-1、11-1-2、15-1-2、18-1-1、27-1-1、27-1-6、35-2-1、35-2-3、65-2-1、65-2-2、S3-1-1、S3-4-1、S8-2-4等35个菌株产孢数量为10～50×104(个/mL)之间；但3-2-4、S3-4-2、S4-1-7、S4-3-1、S8-1-7、S8-1-8、S8-1-9、S8-2-5、S8-4-2、X1-2-1、X7-1-7等11个菌株产孢低于10×104个/mL。以上结果比表明，来源桃江病圃的不同稻瘟病菌株在产孢能力上存在明显差异，其中产孢量在10×104个/mL以上的53个菌株继续生理小种鉴定研究。

表2 桃江病圃分离获得的64个稻瘟病菌株的产饱数量分析

续表2 Continued table 2

2.2 桃江病圃稻瘟病菌生理小鉴定结果分析

对从桃江病圃分离获得的稻瘟病菌进行生理小种鉴定，共鉴定出4群12个生理小种(表3)，即ZA群，仅有ZA1生理小种；ZB群里有ZB1、ZB3、ZB5、ZB11、ZB13、ZB15、ZB31等7个生理小种，ZC群里有ZC3、ZC13、ZC15等3个生理小种；ZG群里只有ZG1生理小种。对各菌群与小种的出现频率进行分析，在ZA、ZB、ZC、ZG 4个种群中，出现频率最高的为ZB，频率为79.2%，其次是ZC，频率为17.0%；频率最低的是ZA、ZG，均仅为1.9%，这表明桃江病圃稻瘟病菌优势种群为ZB。在ZA1、ZB1、ZB3、ZB5、ZB11、ZB13、ZB15、ZB31、ZC3、ZC13、ZC15、ZG1等12个生理小种中，出现频率最高的是ZB15(图1)，频率为39.6%；其后依次是ZB1、ZC3、ZB5；出现频率最低的是ZA1、ZB11、ZC15、ZG1，仅为1.9%；这表明桃江病圃稻瘟病菌的优势生理小种为ZB15。

表3 桃江病圃稻瘟病菌生理小种鉴定结果

7个中国鉴别品种在桃江自然诱发病圃的鉴定结果表明(图2)，诱发品种湘晚籼11号的病级为9级；7个鉴别品种中，丽江新团黑谷为9级，四丰43为8级，珍珑13为7级，皆呈感病(S)反应；其余4个品种特特普、东农363、关东51、合江18均为抗病(R)反应；因此7个鉴别品种在病圃也依次呈现“RSSRRRS”的反应类型，这与优势生理小种ZB15在7个鉴别品种上的反应型吻合。

2.3 桃江病圃稻瘟病菌群体的毒性分析

根据接种菌株在7个中国鉴别品种上的抗感反应，对桃江病圃稻瘟病菌群体的毒性进行分析，表明强毒生理小种ZB1出现频率达15.1%，比例仅次于优势生理小种ZB15，ZB1除了在特特普上呈现抗病(R)反应，其余皆是感病(S)反应(图3-a)。之后按出现频率高低依次是ZB5、ZC3，这两个生理小种的毒性也较强。毒性最强的ZA1在7个鉴别品种上都呈感病(S)反应(图3-b)，在桃江病圃中也被分离鉴定到。以上结果揭示，桃江病圃稻瘟病菌群体的毒性较强。

3 讨 论

7个中国鉴别品种被广泛用于我国各稻区稻瘟病菌生理小种鉴定，其鉴定结果对指导水稻抗稻瘟病育种及抗性品种的合理布局具有重要参考价值[15, 21-23]。湖南桃江病圃是长江中下游国家与湖南省水稻区试新品种的稻瘟病抗性鉴定基地，本研究通过将稻瘟病菌接种于7个中国鉴别品种的离体叶片上，基于抗感反应把2018年桃江病圃稻瘟病菌划分为4群12个生理小种，其中优势种群为ZB，占比79.2%；优势生理小种为ZB15，比例达39.6%。优势生理小种ZB15在7个鉴别品种上的抗感反应型依次为RSSRRRS(R表抗病，S表感病)；2018年将7个鉴别品种种植在桃江病圃使其自然发病，结果也依次呈RSSRRRS的反应型；这表明，离体接种鉴定的优势生理小种类型与田间是吻合的，揭示桃江病圃田间稻瘟病菌的优势生理小种为ZB15。

近年来，尚没有对湖南桃江病圃稻瘟病菌进行生理小种研究的报道。对湖南省而言，最近的报道来自黄红梅等[24]的研究，他们对采自湖南省浏阳、桃江、烟溪等17 个县市的303个稻瘟病菌株进行生理小种鉴定，共鉴定出7 群41个生理小种，其中ZB 为优势种群，ZG1为优势小种，其次为ZB13小种。可见，ZB群是湖南省稻区稻瘟病菌的主要优势种群，而桃江病圃稻瘟病菌的优势种群也为ZB，这表明桃江病圃稻瘟病菌种群在湖南具有代表性。但是，桃江病圃稻瘟病菌群体的优势生理小种、毒性与湖南省存在差异，桃江病圃病菌的毒性明显强于湖南省各地采集分离的病菌，这与周瑚等[25]的研究较为一致，分析其原因主要有：①桃江病圃四面环山、日照时间短、结露时间长、湿度大，极有利于稻瘟病发生，这保证了菌株的大量充分繁殖，同时增强了菌株的毒性变异性；②病圃每年均要承担上万份水稻品种、资源及低世代材料的抗瘟性鉴定，且病圃每年都会淘汰感和高感稻瘟病的水稻材料，保留下来的材料大部分表现中感或中抗水平，能使这些材料致病的菌株往往毒性较强[6]。因此，经桃江病圃鉴定筛选出的抗病品种或资源在湖南省水稻生产与抗性育种上得到了广泛应用。然而，由于7个中国鉴别品种的遗传背景不明，对稻瘟病抗性育种与品种布局的指导作用有限，下一步研究宜利用单基因品种对稻瘟病菌进行致病型划分。

稻瘟病菌诱导产孢是接种前的关键环节，离体接种要求病菌的分生孢子产生量在10×104个/mL孢子以上。本研究通过将稻瘟病菌丝液转移至番茄燕麦培养基上，用蓝黑光连续照射诱导培养获得了大量分生孢子，但不同菌株在产孢能力方面存在明显差异。早期相关研究也表明培养基与光照条件对菌株的产孢量影响最大[26-27]。孙国昌等[26]研究认为玉米粉稻秆培养基最适宜用于稻瘟病菌诱导产孢；王宝华等[27]比较了几种培养基的诱导产孢效果，发现燕麦片培养基诱导稻瘟病菌产孢的效果最好。孙国昌等[26]研究还进一步发现波长310～430 nm的蓝黑光连续照射能显著地促进稻瘟病菌分生孢子的产生。因此，建议番茄燕麦培养基加蓝黑光连续照射以大量诱导稻瘟病菌产生分生孢子。

4 结 论

本研究对2018年分离自湖南桃江病圃的64个稻瘟病菌株进行产孢能力分析，结果表明，番茄燕麦培养基加蓝黑光连续照射可有效诱导这些菌株产生分生孢子，但在产孢能力方面不同菌株存在明显差异。利用7个中国鉴别品种对其进行生理小种鉴定与毒性分析，结果显示，测定的53个菌株被划分为4群12个生理小种，优势种群为ZB，优势生理小种为ZB15，强毒生理小种ZB1出现频率较高，还出现了毒性最强的ZA1小种；这揭示，桃江病圃稻瘟病菌群体的毒性较强，经桃江病圃鉴定与筛选出的抗病品种或资源将在湖南省乃至长江中下游地区的水稻生产与抗性育种上发挥重要作用。