陆 娜，宋吉玲，周小华，沈汉斌，袁卫东*

(1. 杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024；2. 桐庐县农林技术推广中心，浙江 桐庐 311599；3. 嘉善县农业农村局,浙江 嘉善 314100)

【研究背景】双孢蘑菇(Agaricusbisporus)又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇[1]，它是世界性栽培和消费的菇类，是世界上生产量最大的食用菌[2]，有“世界菇”之称。浙江省作为全国双孢蘑菇主产区之一，工厂化栽培逐渐成为主要栽培方式，产量高，质量优，且能周年生产。双孢蘑菇工厂化生产与农法栽培一样整个生长过程中伴随着土壤，覆土层微生物的生长繁殖变化与双孢蘑菇原基形成有着密不可分的关系[3-4]。而覆土层中对双孢蘑菇生长有益的微生物细菌，其产生的不耐热代谢物能够刺激子实体原基的形成[5]。【前人研究进展】Visscher[6]、Rainey[7]等人研究得出致腐假单胞杆菌会促进双孢蘑菇从营养生长向生殖生长转化，John报道在双孢蘑菇子实体形成机制的调节时发现有40种细菌，大多数为假单胞菌，在无菌培养料中能诱导子实体的形成，并提出这些细菌能消除菌丝体生长期产生的一些自抑物质，促进菌丝从营养生长向生殖生长的假说[8]。其中，假单胞菌属、芽孢杆菌属、固氮菌属、链霉菌属对菌丝长势、长速和子实体发育均有明显促进作用[9-10]。【本研究切入点】“冷却—降温”是工厂化栽培双孢蘑菇催蕾的重要阶段，目的就是模拟自然界中夏季到秋季的转变过程刺激双孢蘑菇由营养生长(菌丝体生长)转变为生殖生长(子实体生长)，对降温时机的把控和温度的精确控制，与后期出菇的产量和质量关系密切[11]。微生物是双孢蘑菇覆土层的重要组成部分[12],采用不同的“冷却—降温”处理会让双孢蘑菇覆土层微生物多样性产生更替，使其微生物构成发生变化，而这些变化都会不同程度的影响到双孢蘑菇的生长发育。微生物多样性是基于 Illumina HiSeq 测序平台，利用双末端测序的方法，构建小片段文库进行测序。通过对 Reads 拼接过滤，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示样品的物种构成；进一步进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析和显著物种差异分析等，可以挖掘样品之间的差异。目前，微生物多样性研究主要是在编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行的，细菌主要是基于16S区。目前，浙江地区工厂化双孢蘑菇栽培中降温催蕾时长以6 d左右为主，但并无文献报道相关机理研究。【拟解决的关键问题】因此，本试验在双孢蘑菇生长催蕾期选取4、6和8 d 3种时长，将培养温度由25 ℃匀速降至17.5 ℃对双孢蘑菇进行变温培养，刺激催蕾，对其覆土层的细菌群落进行生物多样性分析，揭示不同变温时长下双孢蘑菇覆土层的物种构成， 挖掘采用不同变温措施之间的差异，以期为双孢蘑菇“冷却-降温”过程中选用最佳变温催蕾时长提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 双孢蘑菇催蕾期不同变温时长的处理

双孢蘑菇培养料取自浙江省嘉善宁远农业开发有限公司，栽培品种为W192，培养料配方：麦草53%、鸡粪40%、石膏4.4%、花生粕2.5%，尿素0.1%，覆土材料为纯草炭土。培养料处理方法一致，选取堆料、发酵、上架及播种时间一致的3个蘑菇出菇房，在催蕾过程中分别以降温时长为4、6、8 d 3个时间段从25 ℃匀速降到17.5 ℃进行处理。

1.2 样品采集

分别对搔菌前(A)、降温前(B)、降温4 d(C)、6 d(D)、8 d(E)和采收期(F)6个时间段的双孢蘑菇覆土层进行采集，在菇房内不同出菇层架取样，每层取3个点，约200 g，将所有样品均匀混合后从中取50 g，每个处理设置3次重复。采收后的样品立即存入液氮速冻转至-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3 DNA提取及测序处理

提取和纯化各处理土样总基因组DNA后，对16S V3+V4区进行PCR扩增，引物为515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R(5’-GGACTACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[13]。PCR反应条件为95 ℃ 10 min， 95 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃ 10 min。产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列，包含测序序列信息以及其对应的测序质量信息的结果以FASTQ文件格式保存。

1.4 生物信息分析流程

根据PE reads之间的Overlap关系，使用 FLASH v1.2.7软件将测序得到的双端序列数据拼接成一条序列Tags，使用 Trimmomatic v0.33软件，对拼接得到的 Raw Tags进行过滤，得到高质量的Tags 数据，同时使用 UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。按照97%相似性进行OTU聚类，通过对SILVA、UNITE数据库进行比对，得到每个OTU的代表物种[14]。基于OTU的分析结果，采用对样本序列进行随机抽取的方法，进行Alpha多样性分析[15-16]，并作出相应的稀释曲线[17]。采用非度量多维标定法(NMDS)通过QIIME软件进行 Beta 多样性分析[18]，比较不同变温处理在物种多样性方面存在的相似程度。

2 结果与分析

2.1 双孢蘑菇覆土层细菌群落OTU划分

通过对双孢蘑菇所有阶段土壤样品测序共获得 3009 758对高质量测试序列，双端测试序列拼接、过滤后共产生2753 152条优化序列数，每个样品至少产生48 594条优化序列数，平均产生65 551条优化序列数。数据表明在所有样本中共产生572个OTUS(图1)，其中变温期间C、D、E分别获得了567、569、566个OTUs。从种群来看(图2)，变温期间C、D、E单独比对，有288个共有种群，在8 d降温和6 d降温2个处理中分别有1个和2个独有种群。

2.2 不同变温处理下细菌群落结构分析

将所有OTU代表序列与参考数据库进行比对可知，从搔菌到第一潮菇采收的过程中细菌分属于14门、31纲、72目、117科、217属、290种。按照不同变温处理下的样本细菌种群在属水平的分类中，物种数量排在前10位的分别是假单胞菌属Pseudomonas、蛭弧菌属Bdellovibrio、根瘤菌属Allorhizobium-Neorhizobium-Parahizobium-Rhizobium、黄杆菌属Flavobacterium、短波单胞菌属Brevundimonas、裂杆菌Pedobacter、腐败杆菌属Peredibacter、诺维赫巴螺菌属Noviherbaspirillum、德沃西亚菌属Devosia和噬氢菌属Hydrogenophaga。其中采用4 d变温处理中假单胞菌属所占的比例最高，为21.2%，且随着变温时长的增加呈现递减趋势；蛭弧菌属情况相反，8 d变温时长下的比例最高，为15.2%，且呈现递增趋势；根瘤菌属4和8 d比例均为5.8%，高于6 d的5.14%，后续排名的细菌种群比例相差不大(图3)。

将前50位的细菌属进行多重序列比对并构建系统进化树，从图4中可见,进化树中每条树枝代表一个物种，树枝长度为两个物种间的进化距离，即物种的差异程度，相同颜色的代表属于同一种属门，结果表明其中30种属于变形菌门Proteobacteria， 14种属于拟杆菌门Bacteroidetes，其余6种属于厚壁菌门Firmicutes和放线菌门Actinobacteria。变形菌门是细菌中最大的一门，包括许多病原菌，拟杆菌门生活在动物肠道类，是粪便的主要微生物种类，主要来源是双孢蘑菇生产中原料是鸡粪、牛粪。

2.3 不同变温处理下细菌的Alpha多样性分析

稀释曲线反映了采用不同变温处理持续抽样下新物种出现的速率，如图5所示，在0～40 000条数范围内，OTU数目呈上升趋势，测序数目在0～10 000条数时，曲线表现为急剧上升，表示此阶段群落中有大量新物种被检测到，当大于10 000条数后曲线趋于平缓，表示此环境中的物种并不会随测序数量的增加而显著增多，可以进行数据分析，说明本次实验的测序量反映出了样品中绝大部分的物种信息。

本次测序样品的OTU覆盖率均在99.8%以上，说明样品文库的覆盖率极高，样品中序列没有被检测出的概率极低，反映本次测序结果可以代表样本中微生物的真实情况。Alpha多样性反映的是单个样品物种丰度及物种多样性，有多种衡量指标，试验根据97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多样性指标的Chao1、Ace、Shannon、Simpson指数对不同变温处理的微生物物种的丰富度和多样性进行了评估。由表2可以看出，Chao1和Ace指数在4 d变温处理下数值最高，分别为522.58和519.05，并且随着变温处理时长的增加而递减，说明在4 d变温处理下细菌物种丰度即物种数量是最多的；Shannon指数刚好相反，4 d最小，随着变温时长增加而递增，在8 d达到4.37，而Simpson指数规律不明显，6 d最高；Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响，相同物种丰度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高[10]，所以8 d变温处理下样品的物种多样性是最高的。

2.4 不同变温处理下细菌的Beta多样性分析

使用QIIME软件进行 Beta 多样性分析，比较不同变温处理在物种多样性方面存在的相似程度，实验主要采用binary jaccard算法计算样品间的距离从而获得样本间的β值。非度量多维标定法[11](NMDS)是一种适用于生态学研究的排序方法，主要是将多维空间的研究对象(样本或变量)简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的数据分析方法。通过不同变温处理样品的分布可以看出它们之间的差异。NMDS分析结果如图6所示，图中点分别表示各样品，不同颜色代表不同不同变温处理，点与点之间的距离表示差异程度，Stress数值为0.1671，表明NMDS分析具有一定的可靠性，从图中可以看出3种变温处理下的样品多样性相似度较高，但4和8 d变温处理在坐标图上距离更近，相似性更为一致。

表1 Alpha多样性指数

3 讨 论

本研究利用高通量测序技术对双孢蘑菇催蕾期不同变温时长处理样本中的细菌核酸序列保守区(16S：V3+V4)进行测序，得到优化序列并进行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类。基于OTU分析结果，共获得 3 009 758 对高质量测试序列，共产生572个OTUS、290个细菌种群，涵盖了14门、31纲、72目、117科、217属、290种。双孢蘑菇催蕾期间，采用不同的降温时长会影响细菌群落在双孢蘑菇覆土层的生长速度导致细菌的含量不同，但不会影响覆土层细菌种类的变化。

假单胞菌属是双孢蘑菇覆土层中检测出含量最高的种群，Reddy[19]等研究表明覆土中假单胞菌的数量越高双孢蘑菇产量也越高。恶臭假单胞菌可显著提高双孢蘑菇菌丝的生长速度及诱导并促进子实体的形成和发育[20]；荧光假单胞菌对鸡腿菇、平菇、双孢蘑菇等有促生作用，可能是通过其 1-氨基环丙烷 -1-羧酸 (ACC)脱氨酶降解食用菌产生的 ACC、减少食用菌乙烯的合成及乙烯对菌丝生长和子实体发育的抑制作用[21-22]。具有固氮作用的根瘤菌属对食用菌产量有重要作用[23]。蛭弧菌对环境细菌数量、群落结构和丰度的影响主要取决于蛭弧菌裂解特性[24]，能够裂解一些革兰氏阴性菌，而覆土层中的细菌群落大部分是革兰氏阴性菌。OTU聚类结果显示随着催蕾降温时长的增加，假单胞菌属含量逐渐降低，蛭弧菌属含量逐渐增加，根瘤菌属含量在4和8 d时最高，加之Alpha、Beta多样性分析结果反映4 d变温处理下细菌物种丰度最多，其假单胞菌属所占的比例最高，说明降温时长为4 d时覆土层中的细菌种群在3个处理中最适宜双孢蘑菇菌丝生长和子实体形成，但形成的子实体的数量个数、产量及层次等与降温时长的关系有待进一步的研究。