许晴雨，许静怡，蔡沛蓉，邹辉，顾建红，袁燕，刘学忠，刘宗平，卞建春*

(1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)，又名F-2毒素，是真菌的二级代谢产物，可通过被污染的谷类食物进入动物和人体内。ZEA具有类似雌激素的作用，对生殖系统有明显的危害，可导致家畜、家禽发生过量雌激素样的代谢综合征[1]。怀孕动物食用含有ZEA的食物会导致流产、死产和胎儿缺陷，雄性动物食用易发生睾丸萎缩、精子活性降低、精子发生障碍等现象。

雄性动物的睾丸主要分为生精小管与管间间质两个部分。睾丸管间间质中的细胞即为睾丸间质细胞，雄性激素主要由睾丸间质细胞分泌[2]。研究表明，ZEA可通过引起睾丸间质细胞发生氧化应激并产生凋亡，从而干扰雄性生殖系统功能。SIRT1为 NAD-依赖性去乙酰化酶，属于Sirtuin-1家族，其主要功能是去除蛋白质上的乙酰基团(去乙酰化)，这一功能在一些生物学过程中发挥着重要作用，如SIRTI能通过脱乙酰化FOXO3 (上调CAT和Mn-SOD)来间接减轻细胞的氧化应激[3]，SIRT1的抑制会降低细胞的应激抵抗，进而促进细胞凋亡[4]；SIRT1 还主要通过FOXO3来调节细胞周期阻滞，高活性的SIRT1有利于细胞生存。SIRT1活性受到细胞中NAD+水平的严格调控。白藜芦醇(resveratrol，RSV)作为COX-1选择性生物抑制杀菌剂，被广泛发现于植物葡萄皮和果皮等植物中，它能够抑制细胞中NADPH的合成。在哺乳动物体内，RSV能激活SIRT1基因组的表达，并且通过改变SIRT1的构象使其更易于与底物结合[5]。本试验以小鼠睾丸间质细胞系(TM3细胞)为研究对象，观察了在RSV的激活下，SIRT1 对于ZEA致睾丸间质细胞的氧化损伤及细胞凋亡的调控作用。本研究可以为制定ZEA雄性生殖毒性的防控措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞

TM3细胞(小鼠细胞睾丸间质细胞系)购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂

玉米赤霉烯酮(Sigma，USA)；白藜芦醇(索莱宝，中国北京)；CCK-8细胞检测试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒(DOJINDO，Japan)；活性氧荧光(DCFH-DA)探针、胎马血清、胎牛血清(Gibco，USA)；双抗(青霉素,链霉素)、谷氨酰胺、胰蛋白酶及其他试剂均为国产分析纯。

1.3 CCK-8法检测TM3细胞活率的影响

96孔板(5×103个/孔)接种TM3细胞，待细胞生长至稳定状态的细胞，分别用0、2.5、5、10、15、20 μmol/L的ZEA对TM3处理24 h，用0、2.5、5、10、15、20、30 μmol/L的RSV对TM3处理24 h，每个浓度设3个重复。按CCK-8∶培养基=1∶10的比例配置预混液，弃去染毒的培养液，预混液以100 μL/孔加入，培养3 h后，用酶标仪在450 nm处测定细胞的吸光度值(OD值)，并计算细胞活率。

计算公式：细胞活率=[(OD试验-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100%。

1.4 qRT-PCR检测细胞SIRT1、SOD和GSH-Px基因表达

将细胞接种在60 孔板中，分成4组，分别设置对照(CON)组、ZEA组(10 μmol/L)、RSV组(5 μmol/L)、RSV+ZEA组(先用5 μmol/L RSV处理30 min，再用10 μmol/L ZEA共处理24 h)，每组设3个重复并处理24 h。随后进行细胞处理，加入预冷PBS，进行1次洗涤，通过Trizol法提取细胞内的总RNA，使用主混合物(Vazyme)试剂盒Hiscript ⅢRTSuperMix for qPCR进行反转录，随后，将每个样品重复3次进行分析，并使用ChamQ SYBR qPCR为Vazyme，制备体积为20 μL的反应混合物。以GAPDH为内参基因，引物序列如表1和表2所示。以基因表达体现倍数变化;通过 2-ΔΔCt进行结果分析。

表1 qRT-PCR检测SIRT1基因表达引物序列

表2 qRT-PCR检测SOD和GSH-Px基因表达引物序列

1.5 实时无标记细胞分析技术(RTCA) 检测细胞活性

将TM3细胞接种在16 孔E-plate检测板中(1×104个/孔)，待细胞生长至对数生长期，进行染毒和药物处理。设置CON组、ZEA组(10 μmol/L)、RSV组(5 μmol/L)、RSV+ZEA组(先用5 μmol/L RSV处理30 min，再用10 μmol/L ZEA共处理24 h)，每组重复3次，使用RTCA仪监测细胞电阻抗值，每15 min记录一次细胞指数。

1.6 DCFH-DA荧光探针法检测TM3细胞活性氧(ROS)水平

将TM3接种于6 孔板(4×105个/孔)，待细胞生长至稳定的细胞状态时，分别设置CON组、ZEA组(10 μmol/L)、RSV组(5 μmol/L)、RSV+ZEA组(先用5 μmol/L RSV处理30 min，再用10 μmol/L ZEA共处理24 h)，细胞染毒24 h。在待处理的时间中，按DCFH-DA∶培养基=1∶1 000的比例加入探针，暗箱孵育30 min。收集细胞，用灭菌的PBS缓冲液洗涤。用500 μL PBS进行细胞重悬，细胞ROS水平采用流式细胞仪检测。

1.7 TM3细胞内丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)含量检测

将细胞接种在60 mm培养皿中，分别设置CON组、ZEA组(10 μmol/L)、RSV组(5 μmol/L)、RSV+ZEA组(先用5 μmol/L RSV处理30 min，再用10 μmol/L ZEA共处理24 h)，每组进行3组重复并处理24 h。处理期间采用预冷PBS缓冲液进行2次洗涤，加入100 μL细胞裂解液并进行超声破碎细胞。随后，分别按照过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒和丙二醛(MDA)测定试剂盒的说明书，检测细胞内的MDA及CAT水平。

1.8 吖啶橙/溴乙锭AO/EB染色法检测细胞凋亡

采用24孔板(4×104个/孔)接种TM3，待细胞生长至细胞状态稳定时，分别设置CON组、ZEA组(10 μmol/L)、RSV组(5 μmol/L)、RSV+ZEA组(先用5 μmol/L RSV处理30 min，再用10 μmol/L ZEA共处理24 h)，细胞染毒24 h。提前配置荧光染色液。将10倍的buffer稀释为1倍，将5 μL的AO试剂及5 μL 的EB试剂加入90 μL 1× Buffer中，充分混匀。待细胞处理时间到，将含毒的培养基弃去，加入预冷的无菌PBS洗涤细胞2次，随后加入荧光染色液避光孵育5 min，弃去荧光液并加入200 μL PBS，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.9 统计方法

采用SPSS 22.0统计软件对试验组间差异进行数据分析，数据结果以“平均数±标准差”表示。相关性检验采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05表示结果差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05差异不显著。

2 结果

2.1 ZEA和RSV暴露对TM3细胞的毒性影响

用CCK-8法检测不同浓度ZEA(0、2.5、5、10、15、20 μmol/L)对TM3 的细胞毒性作用，结果如图1A所示。随着ZEA染毒浓度的增大，TM3细胞活性逐渐下降，与对照组相比，当ZEA浓度在10、15、20 μmol/L，细胞的活性呈现极显著性下降。进一步检测RSV(0、2.5、5、10、15、20、30 μmol/L)对TM3细胞活性的影响，结果如图1B所示。2.5、5 μmol/L RSV对细胞活性不具备显著影响。因此以下试验选择10 μmol/L ZEA及5 μmol/L RSV作为试验浓度。

与对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同

2.2 ZEA暴露对TM3细胞SIRT1基因表达的影响及RSV的激活作用

通过qRT-PCR检测TM3细胞内SIRT1基因表达，结果如图2所示。与对照组相比，ZEA能极显著抑制SIRT1基因表达；与ZEA处理组相比，加入RSV后可以有效激活SIRT1基因。

与ZEA处理组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。下同

2.3 ZEA暴露对TM3细胞增殖活性影响及RSV激活SIRT1后的保护效应

TM3细胞接种16E-plate后，约10 h后进入对数增长期，在细胞生长稳定后24 h进行染毒处理。RTCA试验结果显示，与对照组相比，ZEA组细胞指数有明显下降；与ZEA处理组相比，RSV+ZEA组的细胞指数升高，表明RSV激活SIRT1基因后可部分缓解ZEA所导致的TM3的细胞毒性(图3)。

图3 TM3细胞活性变化情况

2.4 ZEA暴露对TM3细胞内ROS水平的影响及RSV激活SIRT1后的保护效应

细胞染毒处理24 h后，检测TM3细胞的ROS水平(流式细胞术)，试验结果表明，与对照组比，ZEA组细胞内的ROS水平显著性上升(P<0.01)。与ZEA组相比，ZEA+RSV组细胞内ROS水平出现下降趋势但不呈现显著性(P>0.05)。

图4 TM3细胞内ROS水平变化情况

2.5 ZEA暴露对TM3细胞内MDA及CAT的影响及RSV激活SIRT1后的保护效应

TM3细胞内脂质过氧化物MDA水平的检测结果如图5A所示。ZEA可以显著提高TM3细胞内的MDA水平(P<0.01)，RSV激活SIRT1基因后MDA水平上升。细胞内过氧化氢酶活力CAT检测结果如图5B所示。与对照组相比，ZEA组的过氧化氢酶活力显著性下降(P<0.05)；与ZEA组相比，RSV+ZEA组可以有效缓解ZEA所导致的酶活力下降(P<0.05)。

图5 TM3细胞的MDA水平(A)和CAT活性(B)情况

2.6 ZEA暴露对TM3细胞凋亡的影响及RSV激活SIRT1后的保护效应

通过AO/EB染色检测RSV激活SIRT1基因后对ZEA致TM3细胞凋亡的保护作用，其中正常细胞可被AO染色液染成绿色荧光，晚期凋亡的TM3细胞EB可被染色液染为桔红色。由图6可以看出，与对照组相比，ZEA组中桔红色的细胞明显增多；与ZEA组相比，RSV+ZEA组中桔红色细胞明显减少。

图6 TM3细胞凋亡情况(40×)

2.7 ZEA暴露对TM3细胞GSH-Px和SOD基因表达及影响RSV激活SIRT1后的保护效应

通过qRT-PCR检测TM3细胞内GSH-Px和SOD基因表达，结果见图7。与对照组相比，ZEA能极显著抑制GSH-Px和SOD基因表达(图7A)；与ZEA处理组相比，加入RSV激活SIRT1基因后可以有效减缓GSH-Px和SOD基因表达的下降(图7B)。

图7 TM3细胞GSH-Px(A)和SOD(B)基因的表达情况

3 讨论

ZEA作为真菌型毒素，具有非甾体雌激素性作用，产生于镰刀菌属真菌，急性毒性相对较低，啮齿动物的口服半数致死量(LD50)为2 000～20 000 mg/kg[6]。研究结果显示，ZEA具有雌激素类似作用，能够干扰动物机体的内分泌，是一种可以干扰体内环境的活性物质，具有显著的生殖毒性[1]。精子和雄性激素都是雄性生殖系统产生的，且睾丸间质细胞可以并分泌大量的雄激素，约占据雄性激素的95%[7]。目前，一些研究表明，ZEA对睾丸间质细胞的睾酮分泌也有一定的干扰作用，通过诱导TM3细胞活性氧的产生，干扰抗氧化酶SOD、CAT等的活性，引发脂质过氧化物MDA的累积等导致睾丸间质细胞发生氧化应激及凋亡[8]。由此可见ZEA对于养殖业的经济损失不言而喻。

氧化应激是ZEA导致生殖损伤的主要毒性机制[9]。RSV是一种多酚植物素，存在于多种植物和红酒中，是一种有效的抗氧化剂[10]。因此，本研究选用RSV增强SIRT1，探讨SIRT1在ZEA对TM3的氧化毒性下的调控作用。试验前期通过CCK-8法筛选了对TM3具有显著毒性的ZEA浓度，以及对细胞不产生损害的RSV浓度。qRT-PCR法证明RSV可以有效增强SIRT1的基因表达。RTCA结果验证了RSV与ZEA共同作用细胞的细胞活性作用。通过用RSV提前预处理细胞，检测ZEA对TM3细胞的氧化应激相关指标。虽然RSV激活SIRT1基因后没能显著性地缓解ZEA导致的ROS上升，但可以显著性提高CAT活性，有效抑制MDA的过度累积。进一步的试验证明，RSV激活SIRT1基因后可以有效缓解ZEA导致的GSH-Px和SOD基因表达下降效应，说明在RSV激活SIRT1基因后可以有效对抗ZEA诱导的TM3细胞的氧化应激。

佘进进等[11]研究认为，RSV可以通过下调 ROS 水平，来减少 ZEA 导致的凋亡关键蛋白 FasL 的过量表达，降低其与 FasL 的结合，并减少 FADD 与凋亡起始蛋白 Cleaved-caspase8 的表达量，从而减少 ZEA 对 TM4 细胞凋亡的影响。RSV又是SIRT1基因的激活剂[12-14]，SIRT1基因能通过脱乙酰化FOXO3 (上调CAT和Mn-SOD)来间接减轻细胞的氧化应激，Mn-SOD可以有效降低ROS水平，SIRT1的抑制会降低细胞的应激抵抗，进而促进细胞凋亡。SIRT1 主要依靠调节FOXO3的作用来调节细胞周期阻滞。RSV预处理细胞之后,会引起SIRTI的表达增加，脱乙酰化FOXO3蛋白，发挥DNA转录调节功能，导致下游抗凋亡基因和抗氧化基因等表达增加，使细胞产生氧化应激抵抗、DNA 修复和抗凋亡现象。在本试验中，通过用AO/EB染色来检测TM3细胞的凋亡情况，结果表明，RSV激活SIRT1基因后也能抑制ZEA诱导的TM3细胞凋亡，而RSV激活SIRT1基因后，SIRT1具体的调控路径还有待进一步研究。