抑制素-活化素-卵泡抑素系统在哺乳动物生殖系统中的作用机制研究进展

2021-08-06张博琦李纯锦陈璐周虚

畜牧与兽医 2021年8期

张博琦，李纯锦，陈璐，周虚

(吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062)

活化素(activin,ACT)和抑制素(inhibin,INH)最初被作为化合物从卵巢提取物中分离出来，随后，在猪的卵泡液中分离出卵泡抑素(follistatin,FST)[1-2]，三者皆与垂体促卵泡激素(FSH)的合成和分泌紧密相关，简称ACT-INH-FST系统。研究发现，ACT-INH-FST系统通过影响下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌以及其受体的表达，调控FSH和促黄体素(LH)的分泌(图1)[3]。对于雌性动物，FSH和LH与卵泡的生长排卵、雌激素与孕酮的产生、以及卵巢中类固醇激素的循环水平密切相关。在雄性动物中，FSH能够促进睾丸间质细胞分泌雄激素，LH与雄激素协同作用能够促进精子细胞成熟。活化素、抑制素和卵泡抑素及其受体在哺乳动物体内均广泛表达，并参与调控一系列生殖活动。

参考文献[3]改绘

1 活化素、抑制素和卵泡素来源及分子结构特性

1.1 活化素和抑制素来源及分子结构特性

活化素和抑制素是紧密联系的蛋白质二聚体，二者都属于细胞转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，TGF-β家族主要参与调控细胞的分化、成熟以及凋亡[4]。抑制素作为调控下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)的重要激素，主要来源于雌性动物卵巢颗粒细胞和雄性动物睾丸支持细胞。除性腺组织外，抑制素还存在于肾上腺、眼睛、肺脏、肾脏、垂体和脾脏等多个组织，直接或间接影响各组织正常生理活动。抑制素、活化素的前体和成熟形式见图2[5]。

*表示糖基化位点；参考文献[5]改绘

抑制素是一种异二聚体，由α-亚基(20 kDa)与β-亚基(13 kDa)组成见抑制素和活化素的前体和成熟示意图。在人上，抑制素α-亚基位于2号染色体(2q33-q36)上，其5′非编码区含有高度保守的启动子元件Tre、Cre和GATA结合位点，类固醇生成因子(SF-1)结合位点和Smad结合元件[6]。这些启动子位点由激活蛋白AP-1、AP-2、GATA、Smad3/4和cAMP结合蛋白(CREB)进行调控[7]。α-亚基在不同物种之间高度保守，特别是猪和牛，与人的同源性高达85%。抑制素的β-亚基存在两种形式βA-和βB-亚基，分别位于7号染色体(7p15-p13)和2号染色体(2cen-q13)上。βA-亚基由3个外显子和一个2.6 kb的内含子区域组成，启动子区域包含TATA box和几个潜在的特异性蛋白1结合位点；βB-亚基由两个外显子和一个2.5 kb内含子组成，启动子区域富含鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)，且包含多个特异性蛋白1结合位点和3个Cre序列[5]。抑制素主要存在两种形式，抑制素A和抑制素B。α-亚基与βA-亚基组成抑制素A(α/βA)，α-亚基与βB-亚基组成抑制素B(α/βB)。

活化素是抑制素β-亚基的二聚体，具有与抑制素相似的组织分布，但其生理功能与抑制素完全不同[8]。活化素分子量为25 kDa，主要由两个β-亚基βA-和βB-组成，两者分别由不同的基因INHBA和INHBB转录而来[9]。动物体内活化素以同源二聚体蛋白和异源二聚体蛋白形式存在，分别为活化素A(βA/βA)、活化素AB(βA/βB)和活化素B(βB/βB)，三者都通过经典的TGF-β信号通路发挥作用，其中活化素A和活化素B研究最为广泛且与生殖调控密切相关[10]。到目前为止，在人体中成功分离了4个活化素亚基，βA、βB、βC和βE[11]，但其中βC和βE亚基的生理功能还未完全了解。

1.2 卵泡抑素来源及分子结构特性

卵泡抑素是一种富含半胱氨酸且高度糖基化的单链多肽，在结构上与Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂家族同源,是活化素及其他TGF家族成员的拮抗剂。卵泡抑素在动物体内分布广泛，除性腺组织外，在骨骼肌、胰腺细胞、脑脊液、肠上皮中都能检测到卵泡抑素mRNA[12-13]。卵泡抑素是小鼠13号染色体和人类5号染色体的基因产物，基因全长约为6 kb，包含6个外显子和5个内含子。成熟的卵泡抑素由4个结构域组成，包括一个独特的N端结构域(Fs0)和3个卵泡抑素结构域(Fs1、Fs2、Fs3)，其中Fs1和Fs2是活化素的结合域。卵泡抑素通过选择性剪接和蛋白质水解产生3种蛋白质亚型，根据多肽链的长度，分别命名为卵泡抑素315(FST315)、卵泡抑素303(FST303)和卵泡抑素288(FST288)，3种异构体都能与活化素结合并起到重要的调控作用，但3个异构体之间存在功能差异，其主要原因在于它们与硫酸乙酰肝素(HS)的结合能力，Fs288与HS的亲和力最高，FS303次之，Fs315不能与HS结合[3,14]。

2 抑制素-活化素-卵泡抑素系统的受体及作用机制

2.1 活化素受体及信号转导

与其他TGF-β超家族成员相似，活化素信号转导也是通过与丝氨酸/苏氨酸激酶特定受体之间的相互作用，以及激活细胞内Smad蛋白启动的。活化素受体根据分子量的高低，分别被命名为活化素Ⅰ型受体(低分子量，ACTR-I)和活化素II型受体(高分子量，ACTR-II)。研究表明，ACTR-II存在两种同源形式ACTR-IIA和ACTR-IIB，两者都通过激活相似的活化素下游通路发挥作用；ACTR-I也称活化素受体样激酶(ALK)，共存在7个变体[15]，其中，ALK4在活化素信号转导过程中起重要作用。通过对山羊的研究发现，活化素受体是在卵母细胞成熟和胚胎发育过程中合成的，在体外培养的成熟山羊卵母细胞和囊胚中，发现存在活化素Ⅱ型受体，证明活化素受体的表达与卵母细胞的正常发育密切相关[16]。

活化素与细胞表面的两种Ⅱ型受体之一结合时信号转导被触发。结合形成的复合物能够募集ACTR-I并使其发生磷酸化，ACTR-I发生磷酸化被激活后，诱导细胞内蛋白Smad2和Smad3的磷酸化，这些被磷酸化的Smad蛋白释放到细胞质中与co-SMAD、Smad4形成复合物，形成的Smad蛋白复合物转移到细胞核内，在细胞核内它们与DNA结合并调节靶基因的转录。活化素通过上述级联反应调控细胞的增殖、分化、修复和凋亡等效应(图3)。研究发现，Smad7是活化素信号转导过程中的重要调节因子，Smad7与ACTR-I形成复合物时，能够抑制Smad2和Smad3的磷酸化，从而阻断信号转导。此外，反应过程中形成的Smad蛋白复合物，能够通过抑制Smad7调控信号转导[17]。除了激活Smad通路，活化素信号转导在不同的细胞和生理条件下可能存在差异，并可以参与细胞内其他通路的调节，如p38/MAPK、ERK1/2和JNK。

参考文献[8]改绘

2.2 抑制素和卵泡抑素受体及作用机制

虽然人们对于活化素信号转导已经有了比较全面的研究，但是，抑制素信号转导及其作为活化素拮抗剂的分子机制依旧是当今的研究热点之一。最简单的机制表明，抑制素通过与细胞表面ACTR-IIA和ACTR-IIB竞争性结合，实现对活化素信号的拮抗作用。由于抑制素与活化素受体亲和力远低于活化素本身[18]，所以，抑制素在调控活化素信号转导的过程中，可能需要辅助蛋白或辅助受体，这种重要的抑制素辅助受体为β-多糖。β-多糖是一种单次跨膜蛋白多糖,也称III型TGF受体，作为TGF-β和骨形态发生蛋白(BMP)的共同受体发挥作用[19]。试验表明，抑制素与β-多糖细胞外结构域的特异性位点结合后，能够增强抑制素与活化素受体的结合能力，形成的β-多糖—抑制素—II型受体(ActRII, ActRIIB或BMPRII)三元复合物，通过干扰ACTR-I的募集和激活来阻断活化素下游的信号传导。此外，β-多糖高亲和力结合抑制素A，但抑制素B的特异性蛋白尚未被确定，通过对抑制素A在绵羊垂体[20]和小鼠肾上腺[21]中高亲和力结合位点的鉴定表明，抑制素B结合蛋白的作用方式可能与抑制素A相似。

卵泡抑素是一种高亲和力的活化素结合蛋白，其受体除在生殖细胞表达外，在其他类型细胞中也有表达，并参与调控活化素与其受体间的相互作用。活化素和FST有重叠的组织表达模式，机体内FST能够微调节活化素信号以确保内稳态[22]。研究表明，两个卵泡抑素分子与一个活化素二聚体形成复合物，屏蔽活化素上I型和II型受体结合位点，进而阻止活化素信号传导[23]。此外，研究发现一种重要的活化素结合蛋白，卵泡抑素相关蛋白FST-like 3(FSTL3)，FSTL3在结构和功能上与FST相似，与活化素结合后，通过阻止其与活化素受体的相互作用抑制活化素信号转导[17]。最新研究发现，活化素C可能通过与ACTR-II和ACTR-I的结合发挥活化素A受体拮抗剂的作用[23-24]。除上述介绍的抑制剂外，β-多糖、Bambi(BMP and activin membrane-bound inhibitor)和Cripto都被证明，能够通过不同的机制对活化素产生抑制作用。

3 抑制素-活化素-卵泡抑素系统的生理功能

ACT-INH-FST系统对于雌性动物生殖活动具有重要的调控作用。研究发现，活化素受体和抑制素β-亚基广泛存在于雌性动物生殖系统中。原始卵泡形成时，新生小鼠或胎儿卵巢的生殖细胞和体细胞已经开始表达活化素亚基及其受体，其中βA-亚基在卵原细胞中表达，βB-亚基在卵原细胞和体细胞中均有表达。研究发现，活化素A可能通过促进卵原细胞增殖加快原始卵泡的形成，从而参与胎儿卵巢的发育。Martins等[25]发现，活化素A可以诱导体外培养的卵巢碎片中卵原细胞的增殖。此外，在妊娠14～20周人的胎儿卵巢中，检测到Smad2和Smad3的表达，并发现活化素A能够增加体外培养的卵巢组织中Smad2和Smad3的磷酸化水平，表明在原始卵泡形成过程中可能存在局部的活化素信号转导。抑制素、活化素、卵泡抑素的表达水平在卵泡发生过程中经历着动态变化。在初级卵泡和次级卵泡中，活化素亚基在颗粒细胞中表达，但活化素受体及其信号介质Smad2、Smad3和Smad4在卵母细胞中表达[26]。颗粒细胞释放的活化素A可以通过旁分泌途径作用于卵母细胞，刺激卵母细胞生长发育，同时活化素A能够促进卵泡腔的形成。对于有腔卵泡而言，活化素A能够促进其生长和类固醇的合成。研究表明，活化素能够增加大鼠、牛和灵长类有腔卵泡细胞基础芳香化酶活性；刺激小鼠颗粒细胞中雌激素受体的表达和功能[27]；此外，活化素A能够抑制膜细胞产生雄激素，为排卵前卵泡提供有利微环境，研究表明，活化素能够通过减少STAR和3b-HSD的表达来抑制膜细胞雄烯二酮的产生[28]。卵泡发育直至排卵是一个漫长的过程，啮齿类动物需要2周，牛、羊和人大约需要6个月的时间[29]，排卵后，剩余卵泡残余物发生黄体化形成功能性黄体。大多数动物抑制素和活化素亚基在LH峰后下调，在没有受孕的情况下，活化素A促进基质金属蛋白酶2(MMP2)表达上调从而诱导黄体结构和功能退化，开始下一个卵巢周期[30]。

在卵泡发生过程中，抑制素及卵泡抑素同样起到重要的调控作用。雌性动物抑制素主要由卵巢颗粒细胞产生，卵泡生长过程中，抑制素含量随着颗粒细胞数量的增加而增加。所有卵泡类型的颗粒细胞、膜细胞和卵母细胞都表达卵泡抑素、活化素I和II型受体。卵泡发生过程中抑制素A和B的分泌模式并不相同，小卵泡主要分泌抑制素B，优势卵泡和黄体分泌抑制素A。研究表明，活化素是卵泡生长早期重要的旁分泌因子，在此时期抑制素可能参与调节活化素介导的颗粒细胞的增殖和分化，一旦卵泡表达FSH受体(FSHR)，则进一步发育将依赖FSH进行。Lu等[31]研究发现，抑制素A通过抑制FSH诱导的大鼠颗粒细胞FSHR启动子活性和相关mRNA的表达，调节卵泡内FSH水平。在有腔卵泡阶段，卵泡能否继续生长主要依赖于FSH，研究表明，抑制素-活化素系统对于调节有腔卵泡的生长和优势卵泡的选择起到重要作用。在牛卵泡中，卵泡液中激活素A/抑制素A比值和激活素A/卵泡抑素比值，在FSH依赖的卵泡选择阶段均有升高。有腔卵泡发育过程中，抑制素A减缓卵母细胞的发育、促进膜细胞产生雌激素，同时，促进FSH诱导的颗粒细胞分泌雌二醇。卵泡周期结束后，抑制素主要由黄体分泌，抑制素A在黄体中的作用机制尚不清楚，但一些研究表明，它可能以旁分泌的方式促进LH诱导的卵泡膜细胞雄激素的分泌。试验表明，卵泡抑素能够调控活化素和生长激素共同介导的卵泡生长，参与调节颗粒细胞功能、卵泡黄体化和卵泡闭锁。此外，通过基因编辑技术，建立了子宫卵泡抑素基因特异性敲除小鼠模型，并证明卵泡抑素在建立子宫内膜容受性中起到关键作用[32]。

ACT-INH-FST系统对于雄性动物生殖活动同样具有重要作用。雄性动物睾丸是活化素产生的主要场所之一[33]。研究发现，活化素和抑制素是人、猪、牛等哺乳动物睾丸和附睾发育过程中重要的生长和分化因子，正在发育和成体睾丸中，不同类型的细胞均表达抑制素β-A和β-B亚基基因。睾丸中活化素A的主要来源是小管周围肌样细胞和间质细胞，其受体主要定位于睾丸支持细胞，活化素A通过旁分泌扩散到达支持细胞从而影响睾丸的发育。缺乏活化素A的小鼠出生当天睾丸重量显著低于野生型。Mendis等[34]研究表明，在胚胎发育过程中，活化素A亚基在小鼠睾丸中的表达稳步增加，表明活化素A对于雄性性腺发育至关重要。除对睾丸发育影响外，活化素A可能参与控制精子向管腔释放，并可能参与精子穿越血睾屏障的过程，从而使细线期前精母细胞能够传递到管腔内。Nicholls等[35]通过体外试验发现，活化素A能够破坏构成血睾屏障的支持细胞间紧密连接。同时，最新研究表明，活化素A和卵泡抑素，特别是FST288，可能在调节成人附睾和输精管的结构和功能中发挥重要的区域特异性作用[36]。通过免疫研究发现，与雌性动物一样，抑制素对雄性大鼠、仓鼠、绵羊、山羊和牛的FSH分泌起负调节作用，同时，还能够通过旁分泌或自分泌作用调控间质细胞功能和精子发生。抑制素A基因缺乏，会使小鼠睾丸结构破坏从而导致不育，在睾丸中过表达INHBA基因，会导致小鼠精子生成中断，同时，抑制素B与睾丸体积和精液中精子浓度呈显著正相关。