耿笑林，王孟月，张翼，刘鹏，李可乐，杜东颖，逄文强，黄玉欣*，田克恭*

(1. 国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471003；2. 普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471003)

鸡肝炎-心包积液综合征 (hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒血清4型 (fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)引起的一种高度传染性疾病，该病于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区首次暴发，随后在亚洲、欧洲和南美洲等地区流行[1-4]。2015年7月起，由FAdV-4中国流行株引起的HHS在我国山东、河南、安徽和江苏等省份大面积流行[5]，死亡率最高可达80%以上，因为缺乏有效的疫苗进行针对性预防，给我国养禽业带来严重的经济损失。因此，FAdV-4的疫苗研制对防控该病尤为重要。

FAdV-4具有两条纤突，一条长纤突(Fiber-1)和一条短纤突(Fiber-2)，其中Fiber-2蛋白主要是通过识别宿主细胞上的特异受体而使病毒吸附结合在宿主细胞上，对病毒增殖、组装或扩散的某个阶段是必需的，缺失Fiber-2则不能产生病毒粒子[6]，因此Fiber-2是疫苗研制的潜在抗原蛋白之一。

大肠杆菌由于其生长迅速，容易达到高细胞密度和低成本培养基的优势[7]，无论在实验室还是在工业规模上，成为许多重组蛋白(包括Fiber-2蛋白)的首选表达系统。然而，由于缺乏先进的翻译后修饰和真核伴侣蛋白，外源蛋白易聚集以包涵体形态产生[8]。生物系统中存在的各种小分子可以在体外协助蛋白质折叠，以改善蛋白质在多种情况下的错误折叠和聚集，被称为化学伴侣[9]。蛋白质折叠与伴侣蛋白介导的突变缓冲有关，一些化学物质如盐、糖、氨基酸和多聚物被用来提高外源蛋白的可溶性表达[10]。如葡萄糖、蔗糖、甘油等可能会缓冲蛋白表面的突变，山梨醇在体外被广泛用作蛋白质的稳定剂[11]，精氨酸作为蛋白质聚集抑制因子的作用已被广泛认识[12-13]。此外，β-环糊精是一种环状寡糖，呈筒状结构，其两端与外部为亲水性，内部为亲脂性中心，被用来阻止部分折叠蛋白的不可逆性聚集。

本研究在利用大肠杆菌表达Fiber2蛋白时，大部分的蛋白以包涵体形式存在，且不与阳性血清发生琼脂扩散沉淀反应(agar gel diffusion precipitation，AGP)。因此，本研究尝试在培养基中分别加入甘油、葡萄糖、β-环糊精、山梨醇、蔗糖、精氨酸、甘露醇等物质，筛选可以提高Fiber-2的可溶性表达的化学伴侣分子，为进一步的工艺放大奠定基础；同时对表达的可溶性Fiber-2进行免疫原性分析，为进一步研制FAdV-4亚单位疫苗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞、质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；pET28a载体由本实验室保存；引物及基因序列的合成与测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)高保真DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自赛默飞世尔科技公司、FAdV-4阳性血清由普莱柯生物工程股份有限公司制备、鉴定并保存。

酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司；葡萄糖、异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)购自BBI公司；琼脂糖购自TaKaRa公司；甘油、萄糖、β-环糊精、蔗糖、露醇、精氨酸、山梨醇等均为国产分析纯。

1.2 FAdV-Fiber-2重组表达载体的构建及鉴定

根据GenBank公布的Fiber-2基因序列(登录号为FR872912.1)设计合成特异的引物P1和P2。P1序列NcoⅠ-F：5′-CATGCCATGGGCATGCTCCGAGCCCCTAAA-3′，P2序列HindⅢ-R：5′-CCCAAGCTTTTACGGGACGGAGGCTGCT-3′。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。以本实验室分离毒株FAV-HN[14]的DNA为模板，使用引物组P1和P2扩增目的基因片段，PCR反应程序为95 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；PCR产物经琼脂糖凝胶回收后与pET28a载体一同由NcoⅠ和HindⅢ限制性内切酶37 ℃酶切1 h，并进行纯化回收，回收产物由T4 DNA连接酶室温连接1 h，然后转化DH5α感受态细胞；提取转化子质粒，进行酶切验证和测序鉴定。

1.3 重组蛋白FAdV-Fiber-2的表达

将测序鉴定无误的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体平板上，37 ℃过夜培养。次日，挑取单菌落接种于100 mL新鲜LB培养基中(含50 μg/mL硫酸卡那霉素)，37 ℃，220 r/min培养至OD600为0.6左右，加入0.2 mol/L的IPTG并降温至28 ℃诱导表达6 h。

1.4 化学伴侣分子对重组蛋白FAdV-Fiber-2在大肠杆菌中可溶性表达的影响

将重组大肠杆菌FAdV-Fiber-2无菌接种于含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基上，37 ℃过夜培养。次日，挑取单菌落接种于含硫酸卡那霉素的100 mL新鲜LB培养基中(含50 μg/mL硫酸卡那霉素)，37 ℃，220 r/min培养至OD600为0.6左右，此时分别加入40 mL/L的甘油，40 g/L的葡萄糖，2 g/L的β-环糊精，40 g/L的山梨醇，0.4 mol/L的蔗糖，0.1 mol/L的精氨酸，40 g/L的甘露醇，同时加入0.2 mol/L的IPTG并降温至28 ℃诱导表达6 h。

选取添加甘油、蔗糖和β-环糊精的破碎菌体上清液，添加入10 mmol/L咪唑，0.45 μm过滤后，以1 mL/min的流速通过Ni SepharoseTM6 Fast Flow镍柱，随后用上样缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, pH值7.2)和洗杂缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L 咪唑, pH值7.2)分别冲洗镍柱，最后用洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 500 mmol/L 咪唑, pH值7.2)洗脱目的蛋白。收集洗脱产物，并用Zetasizer Nano ZSP系统对纯化后样品进行粒径分析。

1.5 重组蛋白免疫效果评价

为了评价Fiber-2蛋白的免疫效果，将其用PBS缓冲液进行梯度稀释至AGP效价为1∶20、1∶21和1∶22作为抗原，分别与矿物油佐剂按1∶2的比例乳化制备亚单位疫苗。将50只21日龄SPF鸡随机分为5组(A～E)，每组10只。A～C组鸡分别皮下接种0.3 mL亚单位疫苗，Fiber-2抗原的AGP效价依次为1∶20、1∶21和1∶22，D组接种0.3 mL FAdV全病毒灭活疫苗(1 mL抗原中含1×106TCID50的细胞源FAdV)，作为阳性对照组[15]，E组鸡注射无菌PBS作为空白对照组。所有SPF鸡分别于免疫后第0、7、14、21天进行翅下静脉采血，并通过AGP检测血清中针对FAdV的特异性抗体水平。

1.6 检测方法

1.6.1 目的蛋白含量测定

培养结束后，8 000 r/min离心10 min收集菌体，取1 g湿重重悬于40 mL无菌生理盐水中(1∶40)，冰水浴中超声波破碎35 min，破碎条件为：超声功率400 W，工作5 s，间歇15 s。破碎液于2～8 ℃，10 000 r/min离心10 min后取上清，进行SDS-PAGE检测。

1.6.2 不同表达蛋白的AGP分析

采用AGP进行检测，具体方法为：称取1%的琼脂粉，加入0.01 moL/L的PBS缓冲液，水浴煮沸融化后倒入平皿内，厚度2～3 mm，自然冷却。使用打孔器打出7个相邻的梅花孔，挑出孔内琼脂，并在火焰上缓慢加热以对孔底边缘进行封闭。将1.6.1破碎后离心所得上清，用PBS倍比稀释，缓慢加入外周梅花孔中，加满为宜，中间孔加入FAdV阳性血清，尽量避免产生气泡。以PBS缓冲液替代抗原作为阴性对照，中间孔与外周孔之间出现沉淀线判定为一个滴度。

2 结果

2.1 FAdV-Fiber-2重组表达载体的构建及鉴定

以P1、P2为引物，以分离毒株FAV-HN的DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶回收后与pET28a载体一同由NcoⅠ和HindⅢ限制性内切酶37 ℃酶切1 h，并进行纯化回收，回收产物由T4 DNA连接酶室温连接1 h，然后转化DH5α感受态细胞；提取转化子质粒，酶切可得到1 400 bp左右大小的DNA片段(图1)，与预期的FAdV-Fiber-2基因片段大小相等，并进行测序鉴定。

M.DNA分子质量标准(DL5000)；1.重组载体酶切

2.2 重组蛋白FAdV-Fiber-2的表达

重组菌种于37 ℃，220 r/min培养至OD600为0.6左右，加入0.2 mol/L的IPTG并降温至28 ℃诱导表达6 h。经SDS-PAGE分析显示，诱导后的重组菌在60 kDa左右处出现明显表达蛋白条带，与目的蛋白预期分子量相符。上清中目的条带较弱，目的蛋白大部分以包涵体形式存在(图2)。对其进行AGP效价检测，结果见表1，目的蛋白的AGP效价为1∶32。

M.预染蛋白质分子质量标准；1.未诱导上清；2.诱导后上清；3.诱导后沉淀

2.3 化学伴侣分子对重组蛋白FAdV-Fiber-2在大肠杆菌中可溶性表达的影响

重组菌种于37 ℃，220 r/min培养至OD600为0.6左右，加入不同的化学伴侣分子甘油、葡萄糖、β-环糊精、山梨醇、蔗糖、精氨酸、甘露醇，同时加入0.2 mol/L的IPTG，并降温至28 ℃诱导表达6 h。经SDS-PAGE分析显示，诱导后的重组菌在60 kDa左右处出现明显表达蛋白条带，与目的蛋白预期分子量相符。添加甘油、葡萄糖、β-环糊精、山梨醇、甘露醇，都能提升FAdV-4 Fiber-2的可溶性表达量，且添加β-环糊精蛋白表达量显著高于其他试验组，而添加精氨酸、蔗糖，在菌体裂解上清中目的条带的可溶性表达量，与不添加任务化学伴侣分子的对照组无显著差异(图3)。对其进行AGP效价检测，结果见表1。

M.预染蛋白质分子质量标准；1.未诱导上清；2.诱导后上清；3.添加甘油组上清；4.添加葡萄糖组上清；5.添加β-环糊精组上清；6.添加山梨醇组上清；7.添加蔗糖组上清；8.添加精氨酸组上清；9.添加甘露醇组上清

表1 不同化学分子伴侣对FAdV-Fiber-2蛋白表达的影响

选取添加甘油、蔗糖和β-环糊精的样品通过蛋白层析纯化系统进行镍柱纯化，并利用Zetasizer Nano ZSP系统进行粒径分析，结果显示平均粒径和聚合物分散性指数(PDI)均为β-环糊精<甘油<蔗糖(图4、表2)。

图4 不同化学伴侣分子处理后Fiber-2蛋白粒径分析

表2 添加不同化学伴侣分子后Fiber-2蛋白平均粒径和聚合物分散性指数(PDI)结果统计

利用德泰生物的生物信息学工具对Fiber-2蛋白的N端150多个氨基酸序列进行疏水性分析显示其N端存在疏水性较强的结构域(图5)，在诱导阶段加入β-环糊精可能促进Fiber-2蛋白N端区肽链的正确折叠，从而改变三级结构，实现Fiber-2蛋白的可溶性表达量的提升。而蔗糖由于黏度较高，在诱导阶段添加对Fiber-2蛋白的可溶性表达量无正面影响。

图5 Fiber-2蛋白N端的疏水性分析

2.6 疫苗免疫原性分析

用AGP检测免疫后血清FAdV-4抗体，结果显示各组在免疫前和免疫后第7天均未检测到FAdV-4抗体。A组(Fiber-2 蛋白AGP效价为1∶20)鸡于免疫后第14和21天检测到AGP抗体，分别为2/10和5/10。B组和C组(Fiber-2 蛋白AGP效价分别为1∶21和1∶22)鸡于免疫后第14和21天，均检测到AGP抗体。E组(FAdV全病毒灭活疫苗)在免疫后第14和21天，均检测到AGP抗体(10/10)，与B组和C组结果一致(表3)。

表3 不同试验组免疫后抗体反应

3 讨论

FAdVs血清型多、致病力差异大。随着近几年因禽腺病毒感染发生的禽病加剧，给养禽业带来巨大的经济损失[15]，因此，禽腺病毒疫苗的研发显得尤为迫切。Fiber-2蛋白具有型和亚群特异性抗原决定簇，可诱导机体产生主要的型特异性中和抗体[16-17]，对FAdV-4的感染、致病及诊断有重要意义[18]。

由于利用大肠杆菌表达Fiber-2蛋白时，大部分的蛋白以包涵体形式存在。本研究在培养基中分别加入甘油、葡萄糖、β-环糊精、蔗糖、甘露醇、精氨酸、山梨醇等化学伴侣分子物质，发现β-环糊精可以显著提高Fiber-2蛋白的可溶性表达的量。

β-环糊精是一种环状寡糖，呈筒状结构，其两端与外部为亲水性，内部为亲脂性中心，可通过其疏水性内核与未折叠蛋白相互作用掩盖蛋白疏水残基，帮助蛋白重新折叠，从而提高蛋白的可溶性表达量。Du等[19]通过在细胞培养过程中添加β-环糊精来提升单链Fv抗体可溶性表达量，可溶性单链Fv抗体比对照组高出4.17倍。但未见其在大肠杆菌表达系统中的成功应用，有文献报道，在大肠杆菌表达系统中通过添加不同浓度的β-环糊精，未能提升olFN-tau蛋白的可溶性表达量[20]。

Fiber-2蛋白的N端存在疏水性较强的结构域这一特殊的空间结构，加入β-环糊精可能促进了其N端区肽链的正确折叠，从而改变了三级结构，使Fiber-2蛋白的可溶性表达量的提升；同时提示，对于其他类似Fiber-2蛋白这种N端具有较强的疏水性特性的蛋白，可以尝试通过添加β-环糊精这一方法来提高蛋白的可溶性表达。

以可溶性表达的重组fiber-2蛋白为抗原免疫 SPF 鸡，利用AGP检测接种后鸡血清中针对FAdV-4的抗体，抗原AGP效价1∶21和1∶22免疫组与细胞培养的FAV-HN灭活疫苗对照组所有鸡在免疫后第14和21天AGP检测血清抗体转阳，表明重组蛋白抗原进入机体后能够有效刺激机体免疫系统快速产生免疫应答，证明表达可溶性重组Fiber-2蛋白具有较好的免疫原性，且产生的抗体能够与FAdV-4发生特异性抗原抗体反应，抗原可有效刺激免疫系统并产生了较高水平的特异性抗体。

4 结论

研究探索了不同化学分子伴侣对重组Fiber-2蛋白可溶性表达的影响，首次发现β-环糊精可显著提高FAdV-4 Fiber-2蛋白可溶性表达量，为进一步的工艺放大提供了依据，同时为其他同类外源蛋白质在原核中的可溶性表达提供了借鉴。对表达的可溶性Fiber-2进行免疫原性分析，为进一步研制FAdV-4亚单位疫苗提供实验依据。