赵冰茹，陈童，董红，毋状元，罗永明，季斐,4，郑新宝*

(1. 中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2. 新疆畜牧科学院畜牧研究所，新疆 乌鲁木齐 830011；3. 新疆阿勒泰地区畜牧兽医站，新疆 阿勒泰 836501；4. 新疆农业大学动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

胚胎移植技术在充分发挥优良母畜繁殖潜力、缩短世代间隔、提高良种化进程及保存品种资源方面具有重大意义。超数排卵技术是胚胎移植中的一项关键技术[1-2]，通过注射外源性激素来提高血液中促性腺激素浓度，减少闭锁卵泡数量，从而使卵泡发育并排卵。该技术能够为胚胎移植提供大量优质胚胎，是优质种羊进行快速繁育的有效途径[3]，因此研究影响超数排卵的因素对于改善超排效果具有重要意义。

目前，已发现供体羊生理状态、激素水平、超排方案、年龄和胎次等均对超数排卵存在影响[4]。其中与超数排卵密切相关的激素主要是促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和促黄体激素(luteinizing hormone，LH)，卵泡生长需要FSH和LH的作用才能继续发育，在超数排卵中只有有腔卵泡才可以在外源促性腺激素刺激下发生排卵，而有腔卵泡卵泡腔的形成、生长依赖于FSH和LH[5-6]，由此可见FSH和LH对超数排卵的效果有重要影响。抗缪勒管激素(anti-müllerian hormone，AMH)是一种糖蛋白激素，是反映卵巢储存卵泡数量的内分泌标记，而AMH也是由超数排卵中可被外源性促性腺激素诱导发育的卵泡群所分泌，故而可以利用AMH预测供体母畜的超排效果[4]。但是目前关于动物内源性FSH、LH和AMH水平对超数排卵效果影响的报道较少，因此，为了解血清中激素水平对超数排卵效果的影响，本研究测定了萨福克母羊血清中FSH、LH和AMH激素水平，分析其与超数排卵效果的相关性，为改善绵羊超数排卵效果提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物均来自新疆天山畜牧生物工程股份有限公司种羊场，随机选择了60只2～4岁的健康、无繁殖疾病的萨福克羊作为供体母羊。所有试验动物超排前1个月根据供体母羊膘情进行补饲，每只母羊每天精料添至800 g、胡萝卜200 g、苜蓿草2 kg，青贮玉米2 kg，配备舔砖，精料中添加亚硒酸钠等微量元素。进行必要的防检疫和驱虫工作。

1.2 药品和试剂

用于同期发情和超数排卵的药品和试剂有注射用氯前列烯醇钠(PG)、垂体促卵泡素(FSH)、促黄体素释放激素A3(LHRH)，均购自宁波市三生药业有限公司。采卵液为自配，胚胎保存液(Holding)为美国AB公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 同期发情

试验时间为2018年10月，观察供体母羊体况及繁殖周期，确定体况良好、无疾病和不良症状后，开始同期发情和超数排卵处理。供体羊同期发情方法为注射氯前列烯醇钠(PG)1 mL/只(0.1 mg)，1 d后，试情公羊开始试情，3 d内确定发情的羊作为试验羊。将发情羊分为3组，按照发情日开始超数排卵处理。使用FSH减量法对供体母羊进行超排，在发情周期的第11天开始，每天早晚各注射1次FSH，连续注射4 d，第1、2、3、4天的注射剂量分别为4 mg/d、3 mg/d、2 mg/d、1 mg/d，每只羊总剂量为10 mg；在超数排卵第3天时，注射1支PG(0.1 mg)，在母羊发情后14 h进行腹腔镜输精，并注射促排卵素3号(LHRH-A3)1支(25 μg)；在供体母羊发情配种的6～7 d，进行手术法冲胚，同时统计黄体数、回收胚胎数、可用胚胎数等数据。

1.3.2 样本采集

超排前1 d(即发情周期第10天)，采集外周血样品，经3 000 r/min离心10 min后分离出血清，-20 ℃下冷冻保存，用于测定LH、FSH和AMH。

1.3.3 激素测定

血清激素指标的测定均委托专业检测机构进行，采用双抗体夹心法酶联免疫吸附(ELISA)方法，仪器型号: ST-360酶标仪，灵敏度强(最低检测浓度小于1.0 pg/mL)、准确度高(标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.99)、特异性强(不与其他可溶性结构类似物交叉反应)、重复性好(板内变异系数小于10%、板间变异系数小于15%)。使用UNICEL DXI800全自动发光仪检测FSH、LH浓度水平，使用Iflash3000全自动化学发光仪检测血清中AMH浓度水平。

1.4 统计分析

使用SPSS 19.0软件进行LH、FSH和AMH与冲胚效果的相关性分析，并建立回收胚胎数与血清激素间的最优回归模型。

2 结果

2.1 血清激素指标及排卵数统计

由表1可知，萨福克供体母羊的冲胚数据中，平均黄体数为11.00个，平均回收胚胎数、平均可用胚胎数分别为10.30个、6.12个，可用胚率为0.58。测得血清中LH、FSH、AMH含量的均值分别为1.47 ng/L、17.91 U/L、8.13 ng/mL。

表1 超数排卵效果和血清激素指标的统计分析

2.2 血清激素指标及超排效果相关性分析

对萨福克母羊血清中LH、FSH、AMH与黄体数、回收胚胎数、可用胚胎数、可用胚率进行相关性分析，结果表明见表2。LH与黄体数呈显著正相关(P<0.05)，与回收胚胎数、可用胚胎数均呈极显著正相关(P<0.01)，LH与可用胚率无显著相关关系(P>0.05)；FSH与回收胚胎数、可用胚胎数均呈极显著正相关(P<0.01)，与黄体数、可用胚率均无显著相关关系(P>0.05)；AMH与黄体数呈显著正相关(P<0.05)，与回收胚胎数、可用胚胎数均呈极显著正相关(P<0.01)，AMH与可用胚率无显著相关关系(P>0.05)。

表2 血清激素与萨福克羊冲胚数据间的相关系数

2.3 建立最优回归模型

利用血清激素对回收胚胎数进行逐步回归分析，根据回归分析原理，回归模型R2越接近1时，该回归模型越接近实测值，从表3可看出，所建立回归模型中，模型3的R2最接近于1，因此该模型为最优回归模型。从表4中发现，AMH(X1)、FSH(X2)在回归模型中对回收胚胎数影响极显著(P<0.01)，LH(X3)在回归模型中对回收胚胎数影响显著(P<0.05)，因此可得出最优回归模型为Y=-50.041+5.732X1+1.030X2-3.110X3，该模型R2为0.914，而表5方差结果显示，该模型呈极显著(P<0.01)水平，表明由AMH、FSH、LH和回收胚胎数建立的回归模型具有统计学水平的显著，说明该回归模型可用于利用血清激素指标评估回收胚胎数。

表3 回收胚胎数和血清激素回归分析后模型

表4 回归模型回归系数参数估计值

表5 回归模型方差分析

3 讨论

3.1 超数排卵效果分析

胚胎移植技术是家畜快速扩繁中的重要技术，而超数排卵作为其关键技术对于快速繁殖优良种畜十分重要[7]。在动物发情周期的一定阶段，注射超过体内正常量的促卵泡激素类激素，可以拯救99 %即将闭锁的卵泡，使其能够进行正常发育成熟，同时在排卵前注射LH类激素，以此弥补动物体内源性LH的不足，从而使成熟卵泡可以同时排出[8]。

本研究使用FSH减量法对萨福克供体母羊进行超数排卵处理，获得平均可用胚胎数为6.12个，这与苟想珍等[9]超数排卵处理黑头萨福克羊获得6.08个平均可用胚胎数的结果相似，而Song等[10]利用褪黑素处理过的供体母羊获得的平均可用胚胎数为7.40个，略高于本研究，这可能与褪黑激素能够显著提高胚泡率有关[12]。对部分个体由于出现带脓、粘连等原因无法统计出黄体数，以及部分激素检测异常的数据，进行了剔除。

3.2 血清激素与超排效果的相关性

FSH和LH对与卵泡的生长发育是必不可少的，同时在超数排卵中也是十分重要的促性腺激素。其中FSH的主要功能在于其对卵巢卵泡发育的调控[12]，其通过促进对颗粒细胞和卵丘细胞的增殖分化、代谢以及类固醇等的合成，进而发挥对卵泡发育调控的功能。Sirard等[13]研究发现促卵泡素对于体内、体外卵母细胞发育能力的获得有着重要作用；Khan等[14]在体外培养的卵丘卵母细胞复合体中发现，FSH能够诱导卵母细胞生发泡的破裂，而Dinopoulou等[15]研究发现，FSH能够起到改善卵母细胞发育能力的作用。LH在正常的生殖周期中起到恢复成熟卵泡中卵母细胞减数分裂的作用。研究表明，LH通过诱导表皮类生长因子的表达，以及相关信号通路的激活等方式对卵母细胞的成熟以及排卵发挥着重要作用[16-17]，即LH通过其所介导的细胞旁分泌和自分泌的方式，调节卵巢内生殖细胞的变化。综上所述，FSH和LH在卵泡发育及排出中起着不可或缺的作用，在本研究中血清FSH、LH与超数排卵效果的相关性分析发现，FSH、LH与回收胚胎数呈强正相关(0.7≤R<1)，与可用胚胎数也呈中度正相关关系(0.4≤R<0.7)，表明LH、FSH均对回收胚胎数和可用胚胎数有着很大影响。

AMH也被称为缪勒管抑制物质，是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员，是由睾丸未成熟的 Sertoli 细胞及卵巢窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞所分泌的一种糖蛋白。卵巢内的小窦卵泡数量越多，AMH的浓度便越高，反之，当卵泡随着年龄及各种因素逐渐消耗，AMH浓度也会随之降低。研究发现，该激素在小鼠、牛等卵巢中，由生长卵泡内的颗粒细胞特异性表达，且外周血中AMH浓度可以反映出生长卵泡的数量，对卵巢储备的评价和超数排卵效果的预测有重要意义[4]，AMH可作为预测卵巢储备的标志物。本研究在AMH水平与超数排卵效果的相关性分析中发现，AMH水平与回收胚胎数呈强正相关(0.7≤R<1)，与可用胚胎数也呈中度正相关关系(0.4≤R<0.7)。Monniaux等[18]对山羊的研究结果显示，血液中AMH浓度与总胚胎数、可用胚胎数、黄体数呈显著正相关；王立凯[4]在奶绵羊研究结果中发现，AMH与回收胚胎数、可用胚胎数均呈显著正相关；上述结果均与本研究结果一致，表明在一定范围内AMH浓度越高，则可能获得更多的胚胎。

在超数排卵过程中对动物注射外源性促性腺激素，使得母羊排出更多的卵泡。外源性LH量的减少会引起胚胎回收数、可用胚胎数的增加，高剂量的LH会造成可排卵的FSH剂量的增加，并且在超排中使用高浓度的LH会导致卵母细胞发育不成熟，进而降低胚胎质量[19-20]；还有研究认为，超排时内源性LH已经足够，不需要注射LH，而外源性FSH纯化越高，则胚胎的质量越好[21]。因此，在超数排卵过程不能盲目使用促性腺激素，需要根据不同品种、不同环境等选择适宜的超排方案，从而达到更好的超排效果。

3.3 最优回归模型

FSH、LH和AMH作为卵泡发育及排出过程中的重要激素指标，已被报道可联合检测以初步评估卵巢储备功能[22]，本研究通过逐步回归方法建立了血清激素对回收胚胎数的最优回归方程，模型对应R2为0.914，该值越接近1则表示模型越接近真实值[23]，反映出该回归模型用于评估回收胚胎数的可靠性，而通过该回归模型，根据超数排卵前供体血清激素来对回收胚胎数进行预测，可改善优质供体母羊的筛选，进而节约超数排卵成本，改善超数排卵效果。因此本研究认为，通过这3项指标的联合检测来评估超数排卵效果具有重要意义。

4 结论

本研究分析了萨福克羊血清激素与超数排卵效果的相关性，结果表明FSH、LH、AMH与黄体数、回收胚胎数、可用胚胎数均呈正相关关系。在超数排卵过程中，要根据具体品种、条件等设计相应超排方案，监测控制好动物体内激素水平，从而提高超数排卵效果。同时，本研究还建立了最优回归模型：Y=-50.041+5.732X1+1.030X2-3.110X3，可利用血清中AMH、FSH与LH评估回收胚胎数。