吴小延，刘小云，古家美，黄永诗，王 芳，汤 涛

（中山大学肿瘤防治中心∕∕华南肿瘤学国家重点实验室分子诊断科，广东广州 510060）

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是指原发于胃肠道和腹腔的间质细胞肿瘤，占胃肠道肿瘤的1%～4%［1］。早在2003 年，Heinrich等［2］和Hirota 等［3］分别发现并证实了在部分不存在c-Kit基因突变的GIST 中，存在血小板源性生长因子受体α（platelet derived growth factor receptor-al‐pha，PDGFRA）基因突变。在无配体结合的情况下，PDGFRA蛋白仍然能保持持续的自身酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号传导通路［2-3］。PDGFRA突变的患者占GIST患者的5%～10%左右，最常见的突变形式是第18 号外显子D842V 点突变，占所有PDGFRA突变类型的90%以上［4］，大部分PDGFRA突变原发于胃。酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）可以使超过80%的患者获益，延长患者无进展生存时间（progression-free survival，RFS），而imatinib 治疗的疗效与GIST基因突变状态及突变类型直接相关［5］。PDGFRA突变是GIST中少见的一种突变类型，尤其是外显子18 D842V突变导致的GIST 对imatinib 具有高度耐药性［6］，仅有外显子12和外显子18中的D842Y 突变对ima‐tinib 治疗敏感。因此需要新的靶向药物来面对PDGFRA 突变型，特别是外显18 D842V 突变型原发耐药突变GIST 治疗的一大临床难点。本文主要回顾性分析PDGFRA 突变型GIST 的临床病理特征、治疗及预后，以为此类罕见分子病理突变型患者的个体化靶向治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2015 年1 月至2020 年11 月期间中山大学肿瘤防治中心收治的855 例手术切除且经病理确诊为GIST 的患者，回顾性分析其中40 例原发肿瘤组织基因突变检测证实存在PDGFRA突变的患者。每例标本均由2 位病理医生重新复查。其中男性24 例，女性16 例，中位年龄47（33～81）岁。根据《中国胃肠间质瘤诊断治疗共识（2017 年版）》［7］GIST 病理诊断及组织学分型标准：包括梭形细胞型32 例、上皮样细胞型3 例、混合细胞型5 例。按照2008 年改良的NIH 标准进行GIST 危险程度评估分级标准：包括极低危6 例、低危8 例、中危11例、高危15 例。4 例伴随其他癌种，其中肝转移1例，盆腔转移2 例，腹腔内转移1 例。其中2 例患者术前分别接受过imatinib 及avapritinib 治疗。本研究经医院医学伦理委员会批准，且获得所有患者知情同意。

1.2 Sanger测序法

采用石蜡包埋组织切片，按试剂盒说明书进行组织DNA 提取。PDGFRA 基因扩增及测序引物由上海英潍捷基公司合成，外显子12 上游引物序列F：5’TCCAGTCACTGTGCTGCTTC3’，下游引物序列R：5’GCAAGGGAAAAGGGAGTCTT3’，目的片段长度为260 bp。外显子18 上游引物 序列F：5’ACATGGATCAGCCAGTCTT3’，下游引物序列R：TGAAGGAGGATGAGCCTGACC3’，目的片段长度为280 bp。PCR 总反应体系为25 μl：2× Premix‐EXTaqTM 12.5 μL，分别取1 μL上下游引物（10μmol∕L），DNA模板5μL，RNase-free Water 5.5 μL。PCR 扩增条件为94 ℃5 min、94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，共32 个循环；最终72 ℃5 min，12 ℃保温。使用ABI3500XL 型测序分析仪进行双向测序，测序结果使用Chromas 软件与基因组DNA序列进行比对分析。

1.3 免疫组织化学

将石蜡包埋组织行3～4 μm 厚切片，70℃烤片。抗体购自［基因科技（上海）股份有限公司］，全自动免疫组化仪（Leica Microsystems Nussloch GmbH）购自Laica 公司。阳性判读标准：CD117 和Dog1 为胞核和胞质着色，阳性显色为棕黄色。CD34 以肿瘤细胞胞浆或胞膜呈棕黄色为阳性。每批染色切片均设阴、阳性对照各一张。染色结果均由两名副高及以上职称的病理医师独立判定。

1.4 临床资料随访

根据病情对部分患者行imatinib 400 mg∕d 或600 mg∕d 或Avapritinib 300 mg∕d 的治疗方案；其疗效采用Choi 标准［8］进行评估，通过查阅病历、门诊或电话等方式进行随访。无进展生存期（re‐lapse-free survival，RFS）指从手术之日至疾病出现复发、转移或死亡的时间。末次随访时间为2021年1月。

1.5 统计学分析

所有数据均采用R 语言软件进行统计学处理。文中涉及率的比较采用精确Fisher 概率法；生存情况采用通过Kaplan-Meier 法及Log-rank 检验分析D842V 突变组与非D842V 突变组突变患者的无复发生存及总生存。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学特征

40 例患者的标本在显微镜下可见梭形细胞32例（80%，32∕40）、混合型细胞5 例（12.5%，5∕40）、上皮样细胞3 例（7.5%，3∕40）3 种主型，其中梭形细胞呈束状、编织状或栅栏状排列、细胞核多为梭形；上皮样细胞胞浆红染、核圆形及卵圆形、核分裂像少；混合型则同时包含梭形细胞和上皮样细胞（图1）。抗体的阳性表达率为：CD117 27例（67.5%，27∕40）、DOG-134 例（85.0%，34∕40）及CD3432例（80.0%，32∕40）。此外，抗体的阳性表现为：CD34、DOG-1以及CD117等多为弥漫强阳性（图1）。

图1 PDGFRA基因突变型GIST的组织学类型及免疫组化Fig.1 Histological type and immunohistochemistry of PDGFRA gene mutant GIST

2.2 临床病理特征

2015 年1 月至2020 年11 月期间中山大学肿瘤防治中心收治的40 例经病理确诊为GIST、原发肿瘤组织基因突变检测证实存在PDGFRA突变的患者。肿瘤位于胃部34 例（85.0%，34∕40），小肠2例（5.0%，2∕40），胃肠道外共4 例（10.0%，4∕40）。4（10.0%，4∕40）例在诊断时有其他癌种伴随。7 例（17.5%，7∕40）肿瘤最大直径≤2 cm；13（32.5%，13∕40）例肿瘤最大直径＞2，＜5 cm；17（42.5%，17∕40）例肿瘤最大直径≥5 cm 但＜10 cm；3（7.5%，3∕40）例肿瘤最大直径≥10 cm。32 例（80%，32∕40）为梭形细胞型，5 例（12.5%，5∕40）为混合细胞型，3 例（7.5%，3∕40）为上皮细胞型。30 例（75%，30∕40）核分裂象≤5∕50HPF，10例（25%，10∕40）核分裂象＞5∕50HPF。40 例GIST 分别为极低度侵袭危险性6例（15.0%，6∕40），低度侵袭危险性8 例（20.0%，8∕40），中度侵袭危险性11 例（27.5%，11∕40）和高度侵袭危险性15 例（37.5%，15∕40）。术后复发8 例，其中高度危险程度5例，中度危险度2 例，低度危险度1例；术后肝脏转移1 例，中度危险程度（表1）。

表1 PDGFRA 基因突变胃肠道间质瘤患者临床病理特征的关系Table 1 Relationship between clinicopathological charac⁃teristics of patients with PDGFRA gene mutation gastroin⁃testinal stromal tumor

续表

2.3 PDGFRA 突变类型分布

855 例GIST 患者中40 例（4.7%，40∕855）检测到PDGFRA基因突变。在GIST患者中，PDGFRA基因最常见突变位点为18 号外显子第842 位密码子的错义突变（GAC＞GTC，D842V）。本研究40 例PDGFRA突变型GIST患者中，第12外显子突变1例（2.5%，1∕40），即P581S点突变；第18外显子突变39例（97.5%，39∕40）。其中D842V点突变34例（85.0%，34∕40），D842Y点突变2例（5.0%，2∕40），D842-D846＞S（混合突变），I843-D846del 及D842-M844 缺失突变各1例（2.5%，1∕40）。具体突变类型和分布见图2，表2～4。

图2 PDGFRA突变型的Sanger测序结果Fig.2 Sanger sequencing results of PDGFRA mutant

2.4 PDGFRA基因突变GIST与免疫表型的关系

40例GIST 患者中CD117和DOG1的阳性率均＞65.0%，CD117 和DOG1 的表达与PDGFRA基因突变之间无明显相关性（P＞0.05；表2）。Ki-67 增殖指数≤5%、5%～10% 和≥10% GIST 患者中PDG⁃FRA基因突变率的差异没有统计学意义（P＞0.05；表5）。

表2 PDGFRA基因12号外显子突变Table 2 Mutations in exon 12 of PDGFRA gene

2.5 PDGFRA 基因突变GIST 与临床病理特征的关系

40 例GIST 患者中D842V 突变34 例（3.98%，34∕855），非D842V 突 变6 例（0.70%，6∕855）。D842V 突变男性19 例，女性15 例，男女比例1.27：1.00，中位年龄47（33～81）岁。非D842V 突变男性5 例，女性1 例，男女比例5∶1，中位年龄50（44～66）岁。比较两组患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、核分裂象计数、CD117、DOG1 及CD34 表达、Ki-67 增殖指数、改良NIH 分级，差异均无统计学意义（P＞0.05）。另外统计学分析显示：不同性别患者的肿瘤原发部位、发病年龄及肿瘤大小等指标差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 PDGFRA基因18号外显子突变Table 3 Mutations in exon 18 of PDGFRA gene

表4 PDGFRA 突变胃肠道间质瘤患者突变类型Table 4 Types of mutations with PDGFRA mutant gastrointestinal stromal tumors ［n（%）］

2.6 PDGFRA基因突变GIST与预后的关系

2.6.1 靶向治疗 本研究40 例PDGFRA突变GIST患者中有14例患者接受imatinib 辅助治疗。其中1例imatinib 400 mg 治疗4 月后停止用药，23 个月后出现进展；1 例患者imatinib 400 mg 辅助治疗32 个月后进展，imatinib 量提高到600 mg，6 个月后肿瘤未控，后停止用药，改中药治疗至今病情稳定；1 例imatinib 400 mg 辅助治疗15 个月后进展，换达沙替尼100 mg，但1 周后死亡；1 例imatinib 400 mg 辅助治疗13 个月后进展，停止靶向治疗；1 例imatinib 400 mg 辅助治疗18 个月后停药，至今病情稳定。另外有2 例接受avapritinib 治疗，1 例手术后未治疗，复发转移后入组avapritinib 临床试验，5 个月后评估PR；1 例术前接受avapritinib 临床试验，2 个月后评估PR（表5）。除此之外9 例D842V 突变和非D842V 突变患者术后接受了6 个月以上imatinib 400 mg∕d的辅助治疗。

表5 PDGFRA 基因突变靶向治疗病例Table 5 PDGFRA gene mutation targeted therapy cases

2.6.2 复发和转移 本研究末次随访日期为2021年1 月18 日，随访时间为1～63（中位32）个月，35例正在随访中（随访率87.5%），死亡3例（7.5%），均死于GIST。在随访期间，8 例出现复发或远处转移，且均为D842V 突变。生存分析显示D842V 突变患者3 年无复发生存率为97.1%，非D842V 突变患者3 年无复发生存率为100%，两组突变患者的RFS及OS差异无统计学意义（P＞0.05；图3）。

图3 PDGFRA基因突变胃肠间质瘤患者的生存曲线Fig.3 Survival curve of patients with PDGFRA gene mutation gastrointestinal stromal tumors

3 讨论

GIST起源于胃肠道Cajal间质细胞（ICC），是胃肠道最常见的间叶组织源性肿瘤，研究表明，约10%GIST患者存在PDGFRA基因突变［9］。PDGFRA基因的定位与c-Kit在空间上毗邻，也位于人类4号染色体（4q12），基因全长约65 kb，由23 个外显子组成。与c-Kit一样，PDGFRA可以编码Ⅲ型酪氨酸激酶，能将有丝分裂等信号传递入细胞核，引起细胞分裂和增殖，该基因突变可导致恶性肿瘤的产生。

PDGFRA基因在GIST 中的突变主要集中在其编码的近膜区和激酶区，以外显子18 突变多见，其次为外显子12。外显子18 突变集中在841-847位点，以D842V 的点突变最常见，外显子12 突变多为第561位点的点突变，由Val突变为Asp。本研究共纳入40 例PDGFRA突变型GIST，统计显示，PDGFRA突变发生率为4.8%（40∕855），其中D842V突变占85.0%（34∕40），突变频率与国内外报道基本一致［10-11］。40 例PDGFRA突变型GIST患者中，外显子12只有1例（2.5%，1∕40）P581S点突变；外显子18有39例（97.5%，39∕40）发生突变；其中常见的D842V 点突变34 例（85.0%，34∕40），D842Y 点突变2例（5.0%，2∕40），D842-D846＞S 混合突变，I843-D846del 及D842-M844缺失突变各1例（2.5%，1∕40）。本研究还首次发现未曾报道的PDGFRA基因18号外显子D842-D846＞S混合突变。本研究中PDGFRA基因的突变类型、突变位点与以往文献报道有部分差异，可能与研究人群及样本量不同有关。

本组40例PDGFRA突变型GIST 患者肿瘤以胃部34 例（85.0%，34∕40）最多见，其次是胃肠道外共4 例（10.0%，4∕40），还见于小肠2例（5.0%，2∕40）。有研究表明，来源于胃的GIST 的患者预后较好且大多生物学行为呈“良性”［12］。也有文献报道，PDGFRA基因突变病例均为高度侵袭危险性，且患者预后不良［13］。本研究结果显示，肿瘤最大直径≥5 cm 但＜10 cm 者占42.5%（17∕40），核分裂象计数≤5 个∕50 高倍视野者占75.0%（30∕40），NIH 危险度分级以中危和高危为主（65.0%，26∕40）。本组中此类突变多见于发生在胃的中高度侵袭危险性病例。

有研究［14］显示，核分裂计数、肿瘤直径大小、Ki67 增殖指数、危险度分级等是影响肿瘤预后的因素，本研究单因素分析发现，不同性别的患者年龄、肿瘤部位、肿瘤直径大小、核分裂计数、CD117、DOG1 及CD34 表达、Ki-67 增殖指数、改良NIH 分级，差异均无统计学意义。关于性别是否是预后的独立影响因素，之前国内外的研究并不一致［15-17］。也有相关文献［18］报道，年龄≤50 岁的GIST患者PDGFRA 基因突变率明显高于年龄＞50 岁的GIST 患者，本研究结果显示，D842V 与非D842V 两组患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径大小、核分裂计数、CD117、DOG1及CD34表达、Ki67增殖指数、改良NIH分级，差异均无统计学意义。

本研究中GIST 细胞类型以梭形细胞为主，少数为上皮样细胞型及混合细胞型GIST，这种突变类型与肿瘤原发部位的相关性亦见于既往研究报道。李军等［19］研究表明，PDGFRA在上皮样细胞型和混合细胞型GIST 中的突变率显著高于梭形细胞型GIST。此前有研究显示，PDGFRA基因突变与GIST 原发部位及细胞组织学类型等具有相关性［20］。本组病例数量较少，并未发现PDGFRA 基因突变与组织类型有相关性，因此需要进一步大样本研究。

胃肠道间质瘤的指南［21］提示，胃肠间质瘤的准确诊断依赖于病理学、免疫组织化学（CD117、DOG1、CD34 等）及基因检测（Kit的第9、11、13、17外显子及PDGFRA基因第12、18 外显子）。本组中CD117 和DOG1 的阳性率高达85.0%，两者联合检测可显著提高GIST的诊断率。我们发现有部分PDGFRA突变型的CD117、CD34 和DOG-1 是部分阳性和弱阳性，而在c-Kit 或野生型中却没这种情况，因此笔者认为CD117、CD34 和DOG-1 免疫表达的强弱可能与基因型有关。但我们的研究显示，以上基因免疫表达与PDGFRA 基因突变之间没有相关性，CD117 和DOG1 并不能作为预测肿瘤基因突变的指标。

TKI是三磷酸腺苷（ATP）与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂，其作用机制是抑制酪氨酸残基磷酸化，从而阻断下游信号通路的转换，阻止细胞生长。GIST 对常规的放化疗不敏感，imatinib 作为c-Kit的分子靶向药物明显的改善了GIST 的预后。以往研究显示，imatinib可以使超过80%的患者获益，延长RFS［22］。另有一部分病人对imatinib 原发性耐药。GIST 对TKI的治疗反应及用药剂量与GIST 的发生机制有关，尽管c-Kit 与PDGFRA 均属于Ⅲ型受体偶联的酪氨酸激酶家族，但是与c-Kit 突变相比，PDGFRA 基因突变型GIST 的治疗效果较差，研究［23］发现PDGFRA基因D842V 突变是导致GIST 患者imatinib 原发耐药的原因。Yoo 等［24］也证实了PDGFRA-D842V 突变患者对imatinib 完全耐药，不应该接受imatinib 药物治疗。本研究中，10 例D842V 突变型患者手术后进行imatinib 辅助治疗，其中4 例在之后的随访过程中出现复发或转移，6例未获得后续进展情况，由此，可在一定程度上说明PDGFRA-D842V 突变患者并不能从imatinib 靶向治疗中受益。临床研究［25-26］亦表明，多靶点的TKI dasatinib 和新型TKI Avapritinib 对PDG‐FRAD842V 突变的GIST 患者有明显的抑制效果。目前Avapritinib 在美国已经被批准使用，用于治疗携带PDGFRA 外显子18 突变（包括PDGFRA D842V 突变）的不可切除性或转移性GIST 成人患者。我们的研究结果也表明，携带PDG‐FRA-D842V突变的GIST患者可以从dasatinib和avapritinib的治疗中获益。研究［27］证明，在PDGFRA-D842V 突变人群中，有56 位患者中的49 位（88%；95%CI：76，95）有总缓解，其中有5 位（9%）完全缓解和44 位（79%）部分缓解。叶小龙等［17］和Trent 等［28］研究结果同样证明，dasatinib 和avapritinib 均可以使D842V 突变的不可切除或复发转移的GIST 患者获益。我们的研究结果证明，接受avapritinib 治疗的PDGFRAD842V 突变的患者，肿瘤出现明显退缩，且均耐受良好，这给未来此类患者的治疗带来了希望。

综上所述，PDGFRA 的突变多见于胃，病理形态以梭形细胞为主。PDGFRA 外显子18 D842V 点突变为主要突变类型，对ima‐ tinib 不敏感。Avapritinib 是一种高选择性口服激酶抑制剂，能有效缩小D842V 突变GIST 患者的靶病灶，对于晚期PDGFRA-D842V 突变型胃肠道间质瘤患者，avapri‐tinib 具有可控的安全性，并具有初步的抗肿瘤活性。本研究尚存在一些局限性，GIST 病例主要是单中心的回顾性研究，样本量较少，分析存在一些偏差，有待于未来更多的样本对基因突变类型与临床病理特征、治疗及预后进一步研究，以期更好的指导临床用药。