周 芹，宋 艳，李金河，梁青春

（1.中山大学附属第一医院麻醉科，广东广州 510080；2.中山大学附属第一医院病理科，广东广州 510080；3.南方医科大学第三附属医院麻醉科，广东广州 510630）

血管钙化（vascular calcification）是常见的慢性肾脏病血管病变，其发病机制十分复杂。传统观点认为血管钙化仅仅是钙磷矿物质被动沉积于血管壁的过程。但是，越来越多的研究报道：在血管钙化过程中，大量的骨相关蛋白表达上调，改变基因的表达水平可影响血管钙化的发展［1-3］，说明血管钙化是可调控的，治疗血管钙化成为可能。氧化应激是导致慢性肾脏病血管钙化的关键因素［4-5］，抑制氧化应激可成为干预血管钙化的有效策略。血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是抑制氧化应激的关键酶，目前临床上尚无诱导HO-1 表达的药物用来干预血管钙化。柚皮素（Naringenin，NRG）是一种天然的黄酮类化合物，具有清除自由基和抗氧化的作用［6］。研究报道柚皮素可抑制血管平滑肌细胞增殖和血管内膜增生［7-8］，然而柚皮素对高磷高钙诱导的血管钙化是否有效尚不清楚。在本研究中，我们采用血管平滑肌细胞和血管环钙化模型，研究NRG 对高磷高钙诱导的血管钙化的作用，并阐明HO-1 介导NRG 抑制血管钙化的机制，为慢性肾脏病血管钙化的防治提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

细胞培养基DMEM、胎牛血清（FBS）、TRIzol、BCA 蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；NRG、茜素红、β-甘油磷酸、活性氧试剂盒购自Sigma 公司；钙检测试剂盒购自北京雷根生物公司；逆转录反应试剂盒、SYBR green 试剂盒购自Ta‐KaRa 公司；Western blot 超敏发光液购自Millipore公司。

1.2 细胞培养和药物处理

参考文献［9-10］的方法，从雄性SD 大鼠（南方医科大学动物中心，许可证号：SCXK（粤）2011-0015）的胸主动脉分离血管平滑肌细胞。使用含10% FBS 的DMEM 培养基处理大鼠血管平滑肌细胞，代细胞长满后传代。钙化培养基（10 mmol∕L 的β-甘油磷酸+3 mmol∕L 的CaCl2）处理血管平滑肌细胞7 d诱导细胞钙化，普通生长培养基处理的细胞作为阴性对照。为了研究NRG对细胞钙化的影响，在高磷高钙的条件下，用不同浓度的NRG（5、10、20 μmol∕L）处理血管平滑肌细胞7 d。动物的使用已获中山大学附属第一医院动物伦理委员会的批准。

1.3 血管环组织培养和药物处理

分离主动脉血管环［11］，使用1%戊巴比妥钠麻醉处死雄性SD 大鼠，暴露和分离胸主动脉，用眼科剪将其剪成5 mm 左右长的血管环，加入钙化培养基，药物处理组血管环加入不同浓度的NRG（5、10、20 μmol∕L）7 d 后，收集血管标本检测钙化程度。

1.4 检测细胞钙化

参考文献［11-12］，采用茜素红染色法检测血管平滑肌细胞和血管环钙化。将培养皿从细胞培养箱中取出，放置室温下，去除培养基，用PBS溶液洗3 次，加入40 g∕L 的多聚甲醛，固定细胞10 min，然后用去离子水洗培养皿，加入2%茜素红（pH 4.2）溶液孵育5 min，加入去离子水洗去背景色，倒置显微镜下拍摄细胞。加入1 mL 甲酸液体，充分混匀后液体变成黄色，用多功能酶标仪在波长为405 nm处检测吸光值。

1.5 检测血管环钙化

血管环茜素红染色：用40 g∕L 的多聚甲醛固定动脉环，使用梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸泡血管环，包埋好血管环制成血管石蜡块，将其切成5 μm 厚的组织切片，然后脱蜡水化，把切片组织浸泡在2%茜素红溶液中孵育5 min，去除多余染色液，用中性树胶封片保存，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.6 检测钙离子浓度

采用比色法检测钙离子浓度，参考钙检测试剂盒说明书，先用预冷PBS 清洗细胞和血管组织，加入蛋白裂解液处理，然后低温离心（3 000×g，4 ℃，3 min），将上清样品转移至1.5 mL 离心管中，将2.5 μL 的待测样品和钙标准品加入96 孔板中，配制钙离子显色工作液，每孔各加入200 μL 显色液，室温避光静置孵育10 min，使用多功能酶标仪检测在610 nm处的吸光值。

1.7 活性氧水平检测

采用活性氧检测试剂盒检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，去除培养基，用PBS 溶液洗3 次，洗细胞后加入荧光染料二氢乙啶（dihy‐droethidium，DHE），37 ℃避光孵育30 min，然后用PBS清洗细胞，荧光显微镜下拍照。

1.8 荧光定量qPCR

将细胞培养基吸取丢弃，加入1 mL RNA 提取试剂TRIzol，参照试剂公司说明提取血管平滑肌细胞总RNA。取1 μg mRNA，加入Takara PrimeScript RT试剂，将mRNA逆转录为cDNA，配制20 μL PCR反应体系：2×SYBR premix（10 μL），50× ROX Ref‐erence Dye Ⅱ（0.4 μL），Primer mix（0.4 μL），cD‐NA（1μL），ddH2O（8.2 μL），将PCR 反应物混匀随后放入Real Time PCR 仪上，进行荧光定量PCR 反应：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15 s 和60 ℃退火延伸1 min（40 次循环）。所用的引物信息如下：βactin（forward）：TGTCACCAACTGGGACGATA，βactin（reverse）：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA；HO-1（forward）：TTCAGAAGGGTCAGGTGTCC，HO-1（reverse）：CTGTGTGGCTGGTGTGTAAG。采用β-actin为内参基因，2ΔΔCt的方法计算目的基因mRNA的相对量表达水平。

1.9 Western blot

加入蛋白裂解液提取血管平滑肌细胞总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白质的浓度。蛋白样品100 ℃加热10 min 后蛋白质充分变性。每孔上样20 μg蛋白样品，采用8% SDS-PAGE 胶进行电泳分离蛋白，然后将蛋白电转移至PVDF 膜，TBST 洗膜3次，加入5%脱脂奶粉封闭液在室温下孵育1 h。加入一抗HMOX-1 抗体（Proteintech，1：1 000）室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，然后加入二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，加入超敏发光液ECL 试剂，将膜放入LAS 500发光成像仪内曝光显影。

1.10 统计学分析

所有的计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS 软件分析数据，两组以上均值比较采用单因素方差分析（One way-ANOVA）检验，两两比较采用Turkey法。当P＜0.05时被认为有统计学差异。

2 结果

2.1 NRG抑制大鼠血管平滑肌细胞钙化

我们采用含高磷高钙的钙化培养基（calcifying medium，CM）诱导大鼠血管平滑肌细胞钙化。为研究NRG 对高磷高钙诱导的血管平滑肌细胞钙化的作用，在CM 的条件下，不同浓度的NRG（5、10、20 μmol∕L）处理大鼠血管平滑肌细胞7 d。茜红素染色结果显示：普通培养基（Growth medium，GM）处理的细胞未见钙化沉积，CM 组的血管平滑肌细胞钙化明显增强（图1A）；使用不同浓度的NRG（5、10、20 μmol∕L）后，大鼠血管平滑肌细胞钙化程度减轻（图1A），其中以浓度为20 μmol∕L 的NRG效果最为明显。定量分析茜素红染色结果显示（方差分析的F=178.183，P=0.000 3）：与GM 组比较，CM组的细胞钙化明显增强（图1B，P=0.000 02）；与CM 组比较，NRG 处理组的细胞钙化程度明显减轻（图1B，P＜0.001）。另外，不同浓度的NRG（5、10、20 μmol∕L）都能降低细胞钙离子浓度（图1C，P＜0.001），20 μmol∕L 的NRG 效果最好。这些结果说明NRG 可以浓度依赖性地抑制高磷高钙诱导的血管平滑肌细胞钙化，且浓度为20 μmol∕L 的NRG 抑制血管钙化的作用最为明显。

图1 NRG对高磷高钙诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响Fig.1 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced calcification of rat VSMCs

五组定量分析茜素红染色结果比较，经单因素方差分析，五组间差异有统计学意义（F=178.183，P=0.000 3）；采用Turkey 法进一步作两两比较，发现CM 组与GM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 02），NRG（5 μmol∕L）组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 16），NRG（10 μmol∕L）组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 37），NRG（20 μmol∕L）组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 83）。

2.2 NRG抑制大鼠血管环钙化

为进一步研究NRG 对血管钙化的作用，我们采用不同浓度的NRG（5、10、20 μmol∕L）处理血管环7 d。染色结果和定量分析显示（方差分析的F=267.048，P=0.000 04）：与GM 组比较，CM 组的血管环钙化程度明显加重（P＜0.001；图2A、B）；与CM组比较，NRG 处理组的血管环钙化程度明显减弱（P＜0.001；图2A、B）。另外，我们发现：NRG 可显著降低血管组织钙离子浓度（P＜0.001；图2C）。

图2 NRG对高磷高钙诱导的大鼠血管环钙化的影响Fig.2 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced calcification of rat aortic rings

五组定量分析茜素红染色结果比较，经单因素方差分析，五组间差异有统计学意义（F=267.048，P=0.000 04）；采用Turkey法进一步作两两比较，发现CM 组与GM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 37），NRG（5 μmol∕L）组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 32），NRG（10 μmol∕L）组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 17），NRG（20 μmol∕L）组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 44）。

2.3 NRG抑制血管平滑肌细胞氧化应激

由于NRG 具有清除自由基和抗氧化的作用，因此我们研究了NRG 对血管平滑肌细胞氧化应激的影响。结果显示（方差分析的F=29.89，P=0.000 1）：CM 处理可升高血管平滑肌细胞ROS 水平，而使用NRG 可明显降低ROS 水平（图3A、B），说明NRG 可减轻血管平滑肌细胞氧化应激。

图3 柚皮素对高磷高钙诱导的大鼠血管平滑肌细胞氧化应激的影响Fig.3 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced oxidative stress in rat VSMCs

四组定量分析茜素红染色结果比较，经单因素方差分析，四组间差异有统计学意义（F=29.89，P=0.0001）；采用Turkey 法进一步作两两比较，发现CM 组与GM 组比较，差异有统计学意义（P=0.00094），NRG（10 μmol∕L）组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.012），NRG（20 μmol∕L）组与CM组比较，差异有统计学意义（P=0.000 5）。

2.4 NRG上调血管平滑肌细胞HO-1的表达水平

HO-1 是抑制氧化应激的关键酶，我们研究了NRG 对血管平滑肌细胞HO-1 表达水平的影响。qPCR 结果显示（F=248.488，P=0.000 02）NRG（20 μmol∕L）能明显增加血管 平滑肌细胞HO-1 mRNA 的表达水平（P＜0.001；图4A）；Western blot结果也显示NRG 能明显上调血管平滑肌细胞HO-1 蛋白的表达水平（P＜0.001；图4B）。

图4 NRG对大鼠血管平滑肌细胞HO-1表达水平的影响Fig.4 Effect of NRG on HO-1 expression in rat VSMCs

三组HO-1 mRNA 结果比较，经单因素方差分析，3 组间差异有统计学意义（F=248.488，P=0.000 02）；采用Turkey 法进一步作两两比较，发现CM 组与GM 组比较，差异有统计学意义（P=0.009），CM+NRG 组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 8）。

2.5 抑制HO-1 阻断NRG 对血管平滑肌细胞钙化的抑制作用

为了研究HO-1 是否参与了NRG 抑制血管平滑肌细胞钙化的过程，我们观察了HO-1 抑制剂ZnPP9 对NRG 抑制血管平滑肌细胞钙化的影响。结果显示（F=241.933，P=0.000 03）：与CM 组比较，NRG（20 μmol∕L）处理的细胞钙化明显减轻，加入ZnPP9（10-7mol∕L）能明显阻断NRG 对血管平滑肌细胞钙化的抑制作用（图5A、B）；另外，钙定量分析显示：ZnPP9能对抗NRG降低细胞钙离子浓度的作用效应（图5C）。

图5 HO-1抑制剂ZnPP9对大鼠平滑肌细胞钙化的影响Fig.5 Effect of HO-1 inhibitor ZnPP9 on calcification of rat VSMCs

四组定量分析茜素红染色结果比较，经单因素方差分析，四组间差异有统计学意义（F=241.933，P=0.000 03）；采用Turkey法进一步作两两比较，发现CM 组与GM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 49），CM+NRG 组与CM 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 69），CM+NRG+ZnPP9 组与CM+NRG 组比较，差异有统计学意义（P=0.000 02）。

3 讨论

慢性肾脏病血管钙化临床上尚无有效的治疗方法，阐明血管钙化的分子调控机制，寻找其干预靶点具有极其重要的临床价值。在本研究中，我们采用平滑肌细胞和血管环钙化模型，研究NRG 对血管钙化的作用。结果显示：不同浓度的NRG（5、10、20 μmol∕L）均可明显减轻高磷高钙诱导的大鼠血管平滑肌细胞和血管环钙化。由于我们在研究NRG 对血管钙化的作用时，采用了多个浓度NRG（5、10、20 μmol∕L）处理细胞和血管环，其中以NRG（20 μmol∕L）对血管钙化的作用效果最佳。因此，在后续研究NRG 对HO-1 mRNA 和蛋白的表达水平的影响时，采用了20 μmol∕L 的NRG 处理细胞。NRG 降低细胞ROS 的水平，上调HO-1 的表达水平，而抑制HO-1可阻断NRG 减轻血管平滑肌细胞钙化的作用效应。这些结果提示：NRG 可通过诱导HO-1的表达抑制氧化应激和血管钙化。

氧化应激的增强是许多血管钙化相关疾病如慢性肾脏病、高血压、糖尿病等的共同特征。慢性肾脏病血管钙化的病理机制十分复杂，氧化应激是导致慢性肾脏病血管钙化的重要发病机制［5］。在慢性肾脏病血管钙化发展过程中，主动脉氧化应激程度明显增加，而抑制氧化应激可改善动脉钙化［13］。高磷水平能诱导ROS的产生和血管钙化，抗氧化剂能明显抑制氧化应激，延缓血管钙化的发展［14］。本研究表明：高磷高钙可刺激血管平滑肌细胞ROS 的水平升高，促进平滑肌细胞钙化。使用NRG 后可明显降低ROS 的水平，抑制血管平滑肌细胞和血管环钙化。另外，既往研究表明：NRG 可通过促进HO-1 的表达发挥其抗氧化，抗细胞损伤等生物学作用［15-16］。我们的研究也发现：NRG 可增加血管平滑肌细胞HO-1 的表达水平，抑制血管钙化；而采用HO-1 抑制剂后，NRG 抑制平滑肌细胞钙化的作用明显减弱了。这些结果首次证实：NRG可通过调控HO-1抑制血管钙化。

综上所述，在钙磷代谢失调的条件下，氧化应激可诱导血管钙化。NRG 可上调HO-1 的表达水平，抑制氧化应激和血管细胞钙化。调节HO-1 的表达水平可成为干预血管钙化的新策略，我们将采用动物实验进一步验证NRG 通过调控HO-1 的表达抑制慢性肾脏病血管钙化，为NRG 治疗血管钙化提供实验依据。