杜津，何悦，刘敏，曹思源，徐丹,2*，任丹,2

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400700)2(西南大学 食品贮藏与物流研究中心，重庆，400700)

植物精油是指从植物的花、叶、茎、根或果实中提取的挥发性芳香物质，具有消炎、抗菌和镇静等作用。从可食性植物中提取的精油，其成分安全可食，可用作绿色保鲜剂以替代化学防腐剂，在食品保鲜中具有广阔的应用前景，目前常用的有牛至精油[1]、百里香精油[2]、生姜精油[3]、紫苏精油[4]等。但是精油易挥发、易氧化、疏水性强，且具有特殊的味道，极大地限制了其应用。近年的研究表明，采用微胶囊技术将精油进行包封后，一方面可有效地防止其氧化变质，另一方面可达到缓释的目的以延长其作用时间，因此可大大推动精油作为绿色食品保鲜剂的实际应用。

微胶囊技术是指将某一目的物(芯材)用高分子化合物形成的连续薄膜(壁材)完全包覆起来，然后通过外部刺激或缓释作用在一定环境或条件下，将目的物释放出来而发挥其功能。近年来，采用安全无毒的天然高分子作为壁材来包裹可食性功能成分制备微胶囊体系，已成为食品领域的研究热点之一。一方面，包封不稳定和生物利用度低的营养物质，可提高其稳定性和利用度，或实现体内的靶向输送[5]；另一方面，将天然抗氧化和抗菌成分如精油等作为芯材进行包封后，可将其作为长效缓释的保鲜剂用于食品保鲜[6]。以精油为芯材制备微胶囊的方法有分子包埋法、相分离法、喷雾干燥法、溶剂挥发法等[7-10]。其中，以明胶(gelatin，GE)和阿拉伯胶(gum arabic，GA)作为壁材的反应条件温和，制备工艺简单[11-12]，并可采用谷氨酰胺转氨(glutamine transaminase，TG)酶作为壁材交联剂，以替代有毒的甲醛和戊二醛[13]。

柑橘精油主要存在于柑橘果皮或枝叶组织的油胞中，主要由单萜和倍半萜烯碳氢化合物及其含氧衍生物等组成，以柠檬烯含量最为丰富[14-15]。柚子精油(pomelo essential oil,PEO)是柑橘精油的一种，提取于柚子外果皮，具有较好的抗氧化和抗菌效果[16-17]。研究表明，柚子精油对冷鲜肉和苹果等均具有较好的保鲜效果[18-19]。为了防止柚子精油氧化并延长其作用时间，本研究以明胶和阿拉伯胶为壁材，采用TG酶作为交联剂，通过复凝聚法制备柚子精油微胶囊，对其制备工艺进行优化，并对微胶囊的结构和性能进行了表征；在此基础上，考察了精油微胶囊对鲜切苹果贮藏品质的影响，对其保鲜效果进行了验证和评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柚子精油，纯度为99%，江西吉安中南香料厂；TG酶、木瓜蛋白酶，纯度为70%，泰兴市东胜食品科技有限公司；新鲜甘肃富士苹果，重庆本地超市；聚丙烯餐盒(16.8 cm×11.5 cm×4.5 cm)，石家庄创美纸制品有限公司；GE、GA，均为分析纯，上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、草酸、盐酸，均为化学纯，川东化工有限公司；福林酚、碳酸钠、甲醇、无水乙醇、正己烷、冰醋酸，均为化学纯，成都市科龙化工试剂厂；2，6-二氯酚靛酚钠盐、没食子酸，分析纯，重庆市钛新化工有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计(SP-756P)，上海光谱仪器有限公司；气质联用仪(GC-MS-QP2010 Ultra)，日本岛津公司；扫描电子显微镜(Phenom Pro)，荷兰Phenom World公司；荧光正置显微镜(BX53)，日本OLYMPUS公司；差示扫描量热仪(DSC 4000)，美国PerkinElmer公司；热重分析仪(SDT Q600)，美国TA公司；红外光谱仪(Spectrum100)，美国PerkinElmer公司；阿贝折光仪(WAY)，深圳君达时代仪器有限公司；多功能酶标仪(Synergy H1)，美国BioTek仪器有限公司，色差仪(UltraScan PRO)，美国亨利特联合实验室有限公司；果实硬度计(GY-4)，乐清市艾德堡仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 柚子精油的成分分析与抗氧化性能测试

采用GC-MS测定柚子精油的成分，测定条件为：色谱柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；进样口温度320 ℃，进样量0.4 μL，分流比20∶1；程序升温：60 ℃保持4 min后以20 ℃/min的升温速率升至300 ℃，保持30 min。质谱条件：EI模式(70 eV)，m/z范围为10～1 000。

DPPH自由基清除率测定：配制浓度为0.05 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，装入棕色瓶备用。配制质量浓度为4～20 mg/mL的柚子精油无水乙醇溶液，分别量取等体积不同浓度的精油溶液和DPPH溶液混合后，充分摇匀后避光静置30 min，以乙醇为参比调零，于波长517 nm下测吸光度值，标记为AS。然后，分别量取等体积的无水乙醇和DPPH溶液，精油溶液和无水乙醇，混合后进行相同操作，测定得到吸光度AC和AB。同时，将二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)配制成和柚子精油相同浓度梯度的溶液，并进行上述相同操作测定其吸光度，作为阳性对照。按照公式(1)分别计算不同浓度的柚子精油和BHT对DPPH自由基的清除率:

(1)

1.3.2 精油微胶囊的制备和工艺优化

参照文献中的方法[7, 9]，适当修改后进行微胶囊的制备与优化。根据所需壁材添加量，称取等量的GE、GA分别溶解于100 mL蒸馏水，在50 ℃水浴中搅拌30 min。将2种溶液混合后继续搅拌30 min，将温度降至40 ℃后，称取一定量的柚子精油加入上述溶液中，以15 000 r/min的速度高速分散3 min，然后置于40 ℃水浴中搅拌。在15 min内向溶液中滴加10%(体积分数)冰醋酸溶液调节pH至一定值，反应15 min后停止加热，自然冷却至室温后再用冰浴降温至10 ℃以下。然后，在15 min内滴加1 mol/L的NaOH溶液，将溶液的pH调节至6，再加入0.25 g的TG酶，低温搅拌固化3 h得到微胶囊悬浮液。最后，抽滤收集微胶囊并用无水乙醇洗涤至少3次，真空冻干后密封，置于干燥皿中待用。

选取溶液pH值、芯材添加量和壁材添加量进行单因素实验。实验设计如下：(1)采用10%(体积分数)冰醋酸将壁材和芯材混合溶液的pH值分别调节为3.5、3.7、3.9、4.1和4.3，壁材添加量为1%(质量分数)，芯材添加量为0.5%(体积分数)；(2)芯材添加量分别为0.5%、0.625%、0.75%、0.875%和1%(体积分数)，pH=3.9，壁材质添加量为1%(质量分数)；(3)壁材添加量分别为0.5%、0.75%、1%、1.25%和1.5%(均为质量分数)，pH=3.9，芯材添加量为0.5%(体积分数)。分别测定上述条件下制备的精油微胶囊的包封率和粒径。

1.3.2.1 微胶囊包封率的测定

参照LI等[7]的方法，并进行适当修改。首先将柚子精油用正己烷稀释至不同质量浓度溶液，于273 nm处测定吸光度值制作标准曲线。称量0.05 g冻干微胶囊，依次加入4 mL超纯水、5 mL正己烷和0.05 g木瓜蛋白酶，漩涡混合均匀，150 W水浴超声处理180 min使微胶囊壁材溶解并提高萃取效果。然后，在4 ℃下以4 500 r/min的速度离心20 min，取上清液测定其在273 nm处的吸光度，通过标准曲线计算出上清液中的精油浓度。按照公式(2)计算得到包封率：

(2)

式中：n表示上清液中的精油质量浓度，g/mL；V表示上清液的体积；m表示制备0.05 g冻干微胶囊所添加的精油总质量，g。

1.3.2.2 微胶囊粒径的测定

参照XIAO等[9]方法，并进行适当修改。取少量微胶囊悬浮液，均匀涂覆于载玻片上，采用正置显微镜观测拍照，并对照标尺测量单个微胶囊的直径，统计视野内所有微胶囊的粒径和数目，求出其平均粒径，统计数目不少于200个。

1.3.3 柚子精油微胶囊的性能表征

采用单因素优化后的最佳工艺配比(pH=3.9、芯材添加量为0.5%、壁材添加量为1%)制备微胶囊，并进行以下结构和性能的表征。

傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)测定：将GE、GA和冻干后的微胶囊均直接与KBr混合压片后测定，纯柚子精油则涂抹于空白的KBr压片上进行测定。测试时采用的分辨率为4 cm-1，扫描32次，范围为4 000～400 cm-1。

热重分析(thermal gravimetric analyzer，TGA)：称取不超过10 mg的样品进行测定，升温速率10 ℃/min，载气为N2，流速为25 mL/min。

差示扫描量热分析(differential scanning calorimetry，DSC)：称量约4 mg样品于铝坩埚中，加盖压片后测定。温度以20 ℃/min的速度从20 ℃升至250 ℃，保护气体为N2，流速为20 mL/min，以空铝坩埚为参比。

微胶囊形貌测定：取少量微胶囊悬浮液，均匀涂覆于载玻片上，采用正置显微镜观测，放大倍数200倍(物镜×4，电子目镜×20)；冻干微胶囊喷金后用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)观察，放大倍数1 000倍，加速电压为10 kV。

1.3.4 精油微胶囊对鲜切苹果的保鲜效果测定

1.3.4.1 苹果保鲜处理

将本地超市购买的苹果挑选清洗后，去核均匀切分并随机分为5组，第1组不做任何处理，作为对照，记为CK；第2组用精油溶液浸泡3 min后捞起沥干，记为E0，精油溶液通过将5 mL精油与1 L超纯水均质混合得到；另外3组分别用精油微胶囊悬浮液浸泡3、5、7 min后捞起沥干，分别记为EM-1、EM-2、EM-3，精油微胶囊悬浮液的制作方法同1.3.2，采用单因素优化后的最佳工艺配比制备1 L的精油微胶囊溶液，加入的精油总量为5 mL。将以上各组鲜切苹果平铺放置于带盖的聚丙烯保鲜盒中，每组8盒，每盒约140 g，贮藏在温度为4 ℃，湿度为33.3%的恒温恒湿箱中，每2 d取样对各组样品的品质指标进行测定。

1.3.4.2 鲜切苹果的品质测定

采用色差仪测定鲜切苹果的L、a、b值，按照公式(3)计算褐变指数(browning index,BI)[20]:

(3)

采用果实硬度计测定鲜切苹果的硬度，探针直径4 mm，插入深度1 cm。每组测定至少3个样品，每个样品均匀选取3个点进行测定。

参照余易琳等[21]的方法测定鲜切苹果中抗坏血酸的含量，结果以mg/100g表示。

参照TAHIR等[22]方法测定鲜切苹果中总酚的含量，结果以μg/g表示。

由6位经培训后的专业人员每天从各组鲜切苹果中随机选取样品进行感官测评。每位人员在进行各组评估之前，需吃一口无糖饼干，喝一口矿泉水，以消除味觉干扰。鲜切苹果的评价指标分别为颜色、外观、质地、气味、口味和整体可接受度。各评价指标的评分标准见表1，整体可接受度低于5代表失去商品性。

表1 鲜切苹果的感官品质评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of fresh-cut apple

1.4 数据处理

除特别指出外，以上各项实验各组样品均重复测试至少3次，数据均采用平均值±均方差表示，并采用单因素ANOVA进行分析，用Duncan法进行多重比较，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 柚子精油的组成与抗氧化性能

采用GC-MS检测出了柚子精油中含有至少39种物质，其中D-柠檬烯相对含量最高为21.87%，其次为乙酸芳樟酯(21.09%)、D-西尔维烯(8.37%)、左旋β-蒎烯(7.14%)和萜品烯(3.39%)等。D-柠檬烯是单环单萜，广泛存在于水果(尤其是柑橘)皮中，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等生物活性[23]。

图1所示为精油和相同质量浓度的BHT对DPPH自由基的清除率。由图1可看出，BHT具有很强的自由基清除能力，质量浓度为4 mg/mL时其自由基清除率可达94.4%，因此继续增加其质量浓度对清除率无显著影响。而柚子精油对自由基的清除率则随其质量浓度的增加显著上升(P< 0.05)。当质量浓度由4 mg/mL增加至20 mg/mL时，柚子精油对DPPH自由基的清除率由10%增加至35.9%。由此说明，柚子精油对DPPH自由基的清除能力虽然低于BHT，但在一定浓度范围内可通过提高其质量浓度来增强其抗氧化能力。

2.2 精油微胶囊制备工艺的优化

图2所示为精油微胶囊制备过程中的壁材和芯材混合溶液pH值、芯材添加量和壁材添加量对微胶囊包封率和平均粒径的影响。由图2-a可看出，微胶囊的包封率和粒径均随pH值的增大呈先上升后下降的趋势。当pH值为3.7～3.9时，微胶囊的包封率达到最大值45.5%，但pH值为3.9时微胶囊的粒径较小，为138.2 μm。当pH值超过3.9后，虽然平均粒径显著减小，但包封率显著下降(P<0.05)。这可能是由于pH值升高，与明胶的等电点接近时，GE所带正电荷减少，与GA之间的相互作用减弱，导致壁材的包封能力降低[9]。同时，pH值较高时制得的微囊壁材较薄，冻干后易破损。因此，壁材和芯材混合溶液的pH值应控制为3.9。

如图2-b所示，当芯材即精油的添加量为0.5%(体积分数)时，微胶囊包封率为45.3%，此后则随着芯材添加量的增加而降低。这可能是由于精油过量后，容易聚集成液滴悬浮在溶液中或被吸附于微胶囊表面，不易被包封[9]。而微胶囊的粒径则随着芯材添加量的增加呈波动状态，且芯材添加量过高会导致粒径分布范围增大。因此，为了提高包封率，减少浪费，芯材添加量为0.5%(体积分数)为宜。

由图2-c可看出，随壁材添加量增加，包封率呈现先上升后下降的趋势，至1%达到最大值，为45.3%；平均粒径则随壁材添加量的增加而降低。当壁材添加量超过1%时，溶液黏度增大，制备的微胶囊形状不规则，且易分散，因此壁材添加量为1%为宜。

综合以上实验结果，精油微胶囊的最佳制备工艺选择为：pH值为3.9，芯材添加量为0.5%(体积分数)，壁材添加量为1%(质量分数)。后续表征和用于鲜切苹果保鲜的微胶囊悬浮液均为在此条件下制备得到。

2.3 微胶囊的性能表征

2.3.1 FTIR谱图分析

2.3.2 TGA

图4所示为精油微胶囊、空白微胶囊及其原料的热重曲线。其中，柚子精油由于富含挥发性成分，在104.4 ℃时分解最快，200 ℃时质量损失已达96.12%。GE、GA及空白微胶囊则在310 ℃附近达最大分解速度，但空白微胶囊在600 ℃时的残留质量高于纯的GE、GA，可能是由于两者的相互作用增强了空白微胶囊的热稳定性。包封精油后的微胶囊其热重曲线与空白微胶囊较为接近，但600 ℃时的残留物质量显著降低，可能是由壁材分解后其内包封的精油迅速挥发所致。

2.3.3 DSC分析

精油微胶囊、空白微胶囊及其原料的差示扫描量热曲线如图5所示。从中可看出，GA在60 ℃和123 ℃附近出现了较宽的吸热峰，可能分别由自由水和结合水的挥发所致[24]；GE在110～120 ℃，150～160 ℃，以及170～180 ℃分别出现了吸热峰，除了归因于自由水、结晶水的蒸发外，也可能是由GE分子间氢键作用的变化所导致[25-26]。空白微胶囊出现了和GA类似的2个峰，但出峰位置向右发生偏移，说明GA和GE的相互作用使两者的结构发生了变化[24,27]。精油微胶囊只在122 ℃出现了1个吸热峰，说明精油的包封减少了壁材中的水分含量，且该温度略高于纯精油最大吸热峰出现的温度(120.3 ℃)，说明精油被包封后可减缓精油的挥发。

2.3.4 微胶囊的形貌分析

如图6所示，冻干前的空白微胶囊具有规则的球形结构，分散较均匀；精油微胶囊具类似的球形结构，但内部有芯材填充。冻干后，空白微胶囊由于内部失水，壁材塌陷而形成褶皱；而冻干后的精油微胶囊保持了较为平滑完整的结构，说明在冻干过程中，壁材可较好地保护内部的柚子精油，从而保持微胶囊的球形结构。

2.4 柚子精油微胶囊对鲜切苹果的保鲜效果

鲜切苹果在贮藏期间的褐变程度用BI指数表示，其数值越大表明褐变程度越严重[20]。由图7-a可看出，在整个贮藏期间，各组果实的BI指数均呈上升趋势，但CK组的上升速度显著高于其余组。至第14天时，CK组的BI指数已经超过130，比最低值的EM-1组高出49%。各处理组中，E0、EM-2和EM-3的BI指数几乎无显著差异，EM-1组的褐变程度则显著低于其他组(P< 0.05)。这可能是由于E0组中精油挥发过快，而EM-2和EM-3浸泡时间过长，会增加苹果的损伤，因此采用精油微胶囊浸泡3 min对苹果的褐变抑制效果最好。柚子精油中含有的醛类、醇类等化合物可在一定条件下转化为醇类，具有抑制多酚氧化酶活性的作用，从而可延缓鲜切水果的褐变[28]。

图7-b显示，鲜切苹果的硬度随着贮藏时间的延长而下降，且EM-2和EM-3组的硬度显著低于其他3组(P< 0.05)，可能是这2组的浸泡时间过长，造成鲜切苹果中水分过高，细胞组织软化导致硬度下降。E0组和EM-1组浸泡时间较短，在前10 d与对照组无显著性差异，但在贮藏14 d时EM-1组的硬度显著高于其他组(P< 0.05)，说明精油微胶囊短时浸泡可较好地保持鲜切苹果的硬度。

抗环血酸是果蔬的基本营养物质，因此其含量是衡量水果营养价值的重要指标之一[29]。如图7-c所示，各组果实的抗环血酸含量均随贮藏时间的延长而波动变化，在第6～10天为最低值，随后上升再下降。且在贮藏前10 d，EM-1组抗环血酸含量相对较高，之后与其他组无显著性差异，说明精油微胶囊在贮藏的前10 d均可较好地发挥抗氧化功能，以维持较高鲜切苹果中较高的抗环血酸含量。

酚类化合物在苹果中的含量较高，且与果实的总抗氧化能力密切相关[30]。如图7-d所示，从第2天开始，各组的总酚含量几乎均呈先上升后下降的趋势，且在前8 d，EM-1组的上升速度显著高于其他组，后期各组无显著性差异。在整个贮藏期间，E0和EM-2组的总酚含量与对照组几乎无显著性差异，EM-3组则呈现较低的含量。由此说明，采用精油微胶囊溶液浸泡3 min可较好地维持鲜切苹果的总酚含量，浸泡时间过长反而有不利影响。

图8为贮藏至第2天和第8天时，鲜切苹果各项指标的感官评分以及外观图片。由图8可看出，第2天时，对照组已经发生了明显的褐变，但口味和气味的评分较高。E0组由于精油本身味道的影响，在口味、气味和整体可接受度方面得分均较低。而精油微胶囊处理组则较好地降低了精油味道对鲜切苹果的影响，并且能够提升样品的外观和质地，整体接受度均优于E0组。到第8天，各组样品的感官评分均有明显下降。对照组虽然在口味和气味方面仍占据优势，但由于褐变严重，质地变软，整体可接受度的评分较低。E0组的各项指标评分均为最差，整体可接受度的评分已经低至5，即将失去其商品价值。而精油微胶囊处理组中，EM-1组的口味和气味评分略低于对照组，但质地、颜色和整体可接受度的评分均为最高，较对照组有明显提升。从鲜切苹果的外观图片也可看出，EM-1组能够较好地抑制鲜切苹果的褐变，更容易被消费者所接受。由此说明，直接用精油对鲜切苹果进行处理，不但不能起到护色和保鲜的目的，反而会因为精油本身的味道对样品的商品性造成不良影响。将精油采用微胶囊包埋后，对鲜切苹果进行短时浸泡处理，则可较好地防止褐变并提升质地，从而提高其整体可接受度。

以上结果表明，将鲜切苹果用精油微胶囊溶液浸泡3 min，可较好地抑制其在贮藏期间的褐变，保持其硬度，维持较高的抗环血酸和总酚含量，并能改善其感官品质，提高商品性，从而显著提高其贮藏品质。由此说明，精油微胶囊附着在鲜切苹果表面，可在贮藏期间持续释放精油，以达到抗氧化和保鲜的作用。采用相同浓度的精油溶液浸泡或者延长浸泡时间，则效果不显著甚至比对照组更差。这可能是由于纯精油附着在鲜切苹果表面后便很快挥发，无法起到持续保鲜的效果，而浸泡时间过长，则会对果实组织结构造成损伤。

3 结论

本研究以明胶和阿拉伯胶作为壁材，采用复凝聚法对柚子精油进行包埋，制备了精油微胶囊。通过单因素实验确定了微胶囊的最佳制备工艺为：pH值为3.9，芯材添加量为0.5%(体积分数)，壁材添加量为1%(质量分数)。此时，微胶囊的包封率达45.3%，平均粒径为138.2 μm。对在此条件下制备的微胶囊进行表征发现，明胶和阿拉伯胶通过静电相互作用发生复凝聚，对柚子精油进行包封，且包封后其热稳定性得到改善。形貌分析结果表明，微胶囊冻干前具有规则的球形结构，冻干后也能较好地保持其形貌。将鲜切苹果用精油微胶囊悬浮液浸泡3 min，可较好地抑制其褐变，延缓硬度的下降，能维持较高的抗环血酸和总酚含量，并且受精油气味影响较小，消费者接受程度较高。因此，本研究所制备的精油微胶囊能较好地提高果蔬的贮藏品质，有望作为绿色保鲜剂应用于果蔬等农产品的贮藏。