邵宇，张显，胡孟凯，魏玉霞，杨套伟，徐美娟，邵明龙，高敏杰,饶志明

(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸[1]，是一种小分子天然有机酸，广泛存在于干酪、天然蜂蜜中。溶解性良好，具有耐酸、耐碱、耐高温等特性[2]，并能有效的抑制食腐性微生物[3]的生长，在食品工业中具有广阔的应用前景。L-苯乳酸(L-PLA)作为PLA两种对映异构体中的一种，是合成许多药物制剂的前体[4]。

合成L-PLA方法主要为化学合成法、微生物发酵和生物催化合成。化学合成法[5]技术路线复杂，反应条件苛刻，易产生环境污染，后续分离困难，不易纯化。微生物发酵法[6]通过微生物分解与合成代谢生产PLA。由于其发酵周期长，培养基利用率不高，生产效率低，不具工业利用价值。基因工程和蛋白质工程[7]的发展使得生物催化技术得到广泛的运用。XU等[8]通过在大肠杆菌中共表达源于干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的酮酸还原酶(LcKAR)和葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH)，以苯丙酮酸(phenylpyruvic acid，PPA)为底物不对称合成PLA，时空产率达到10.12 g/(L·h)。LUO等[9]研究中以PPA为底物目前产量达到20.5 g/L。近几年以PPA为底物合成PLA的研究较多，关于苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)一步合成PLA的报道相对较少，且PPA价格偏高，挖掘能够成本低廉并高效转化的生物催化合成PLA方法是未来研究亟待解决的问题。

L-氨基酸脱氨酶(L-amino acid deaminase，L-AAD)可以用来催化Phe生成PPA，L-AAD有广泛的底物特异性[10]，对疏水性氨基酸有显著催化特性，L-AAD是膜蛋白[11]，更有利于制备全细胞催化剂。苯丙酮酸还原酶(phenylpyruvate reductase,LaPPR)是一种还原型辅酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide health，NADH)依赖型的氧化还原酶，具有对芳香族和脂肪族酮酸的底物偏好[12]。本研究首次将L-AAD和LaPPR用于催化L-苯丙氨酸(L-Phe)合成L-PLA。考虑到还原性辅酶NADH稳定性差，价格昂贵，提高成本，不适合外源添加[13]，其中，GDH和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase , FDH)是构建辅酶再生体系最常用的酶[14]，通过对辅酶再生酶的筛选，制备全细胞催化剂转化合成PLA。旨在为L-PLA生产建立一种简洁、高效、经济的生物催化合成方法，为其工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)及质粒pET-28a均为本实验室保藏。

1.1.2 酶和试剂

Hind Ⅲ、NotⅠ、XhoⅠ限制性核酸内切酶与DNA聚合酶，TaKaRa公司；小量质粒提取试剂盒、同源重组试剂盒和胶回收试剂盒，南京诺维赞生物科技有限公司；L-Phe、L-苯丙酮酸、L-PLA，国药集团；酵母提取物和胰蛋白胨，英国Oxoid 公司。所有实验试剂如果无特殊说明均为分析纯。

1.1.3 培养基

LB种子培养基(g/L)[15]：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0。

TB发酵培养基(g/L)[15]：蛋白胨 12，酵母粉 24，甘油5，KH2PO42.31， K2HPO412.54。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

通过NCBI数据库获得编码普通变形杆菌Proteusvulgaris来源的L-AAD基因、乳酸杆菌Lactobacillussp. CGMCC 9967苯丙酮酸还原酶的基因序列，选择酶切位点，设计并合成多对引物，序列如表1所示。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重组质粒的构建

根据NCBI中公布的普通变形杆菌P.vulgaris来源的L-AAD基因laad(GenBank登录号：AB030003.1)、乳酸杆菌Lactobacillussp.CGMCC 9967来源的LaPPR基因[16]lappr(GenBank登录号：KP735960.1)、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis来源的GDH基因[16]gdh(GenBank登录号：938261)以及博伊丁假丝酵母Candidaboidinii的FDH基因[16]fdh(GenBank登录号：7657866)序列设计引物，分别以各自基因组为模板，进行PCR扩增， PCR产物laad、lappr、gdh和fdh经过试剂盒纯化后，连接载体pET-28a，转化E.coliBL21(DE3)中。

将gdh基因克隆到重组表达载体pET-28a-lappr的MCS位点上，引入限制性酶切位点NcoⅠ，用各自的T7启动子进行表达，构建pET-28a-t7-gdh-t7-ppr共表达质粒。选择限制性酶切位点XhoⅠ，将laad基因克隆到重组质粒上，构建pET-28a-t7-gdh-t7-lappr-t7-laad共表达质粒，转化E.coliBL21(DE3)中，涂布平板，并过夜培养，挑取阳性转化子，送至测序，若正确，即重组菌株E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh构建成功。

1.2.3 重组菌的培养及诱导

重组菌E.coliBL21/pET28a-laad、E.coliBL21/pET28a-lappr、E.coliBL21/pET28a-gdh、E.coliBL21/pET28a-fdh、E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh，1%的接种量转接入含Kan 50 μg/mL的种子培养基，37 ℃、180 r/min，培养12 h。再按2%的接种量接入发酵培养基，37 ℃，菌体OD600值为0.4～0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.5 mmol/L，24 ℃、180 r/min诱导12 h[15]。

1.2.4 酶活测定

诱导后的大肠杆菌发酵液于4 ℃离心(8 000 r/min，5 min)收集菌体，用PB缓冲液(0.1 mol/L，pH为8.0)重悬菌体沉淀，低温超声破碎，并在4 ℃条件下高速离心后，获得破碎上清液，即为粗酶液，进行SDS-PAGE分析及酶活力测定[17]。酶活力测定分别参考HOU等[12]、XU等[8]的报道。

1.2.5 酶学性质

酶最适反应温度和最适反应pH测定：在25、30、35、40、45、50 ℃下测定酶活力，分析确定酶反应的最适温度，设置酶活力最高组为100%对照[15]。在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的条件下测定酶活力，分析确定酶反应的最适温度，设置酶活力最高组为100%对照[18]。

酶温度和pH稳定性测定：取适量纯化的酶置于不同温度(25～45 ℃)下，在最适pH条件下定时取样测定残余酶活力，以最高残余酶活力为100%计算相对酶活力。取适量纯化的酶置于不同pH(4.0～10.0)条件下，在最适温度条件下定时取样测定残余酶活力，以最高残余酶活力为100%计算相对酶活力。

1.2.6L-PLA的合成及条件优化

利用重组菌E.coli/pET28a-laad-lappr-gdh进行全细胞转化环合成L-PLA，以L-Phe作为底物，同时加入辅底物葡萄糖及5%(体积分数)的甘油，转化体系为20 mL，转速220 r/min进行反应，反应过程中通过添加适量的NaOH来调节反应体系的pH。

全细胞转化体系的优化：在不同的温度(25～45 ℃)、初始pH(6.0～9.0)、菌体量OD600(10～50)、底物质量浓度(20～50 g/L)、辅底物与底物摩尔质量比(0.5∶1～4∶1)的条件下进行L-PLA的转化实验。HPLC法检测产物L-PLA的产量的具体方法参考黄国昌等[19]的检测方法。

2 结果与分析

2.1laad,lappr,gdh及fdh基因的克隆与表达

从 NCBI 数据库中检索到L-AAD、LaPPR、GDH、FDH的序列，长度分别为1 416、1 047、789、1 197 bp，分别作为模板，进行 PCR 扩增，电泳结果如图1所示，可见特异性条带位置与目标基本一致。

M-DL 10 000 marker;1、2-基因 gdh;3、4基因 lappr;5～7-基因laad图1 基因的克隆Fig.1 The result of gene cloning

2.2 温度和pH对L-AAD及LaPPR酶活力和稳定性的影响

2.2.1 温度对L-AAD和LaPPR酶活力和稳定性的影响

在不同反应温度下测定L-AAD酶活力，如图2-a，L-AAD的最适反应温度为35 ℃，存在较高酶活力，温度高于40 ℃，酶活力下降。图2-b中显示，L-AAD在30～40 ℃较稳定，酶活力保持在75%以上，而在45、50 ℃条件下，则迅速降到40%以下，可见在30～40 ℃有较好的稳定性。

在不同反应温度下测定LaPPR酶活力，如图2-c，LaPPR的最适反应温度为30 ℃，并具有较高酶活力，温度高于35 ℃，酶活力下降。图2-d中显示，LaPPR在25～35 ℃比较稳定，酶活力保持在80%以上，而在40～45 ℃条件下，相对酶活力迅速降到20%以下，这表明在25～35 ℃有较好的催化性能和热稳定性。

2.2.2 pH对L-AAD和LaPPR酶活力和稳定性的影响

在不同pH条件下测定L-AAD酶活力，结果如图3-a所示，随着反应体系pH的逐渐提高，L-AAD 的相对酶活力也逐渐提高，L-AAD的最适反应pH值为8.0，在pH 7.0～9.0具有较高酶活力。图3-b中显示，当处于偏酸性环境中时，L-AAD稳定性较差，相对酶活力降到50%以下；在pH 7.0～9.0偏中性范围内比较稳定，酶活力保持在80%以上，有利于其在生物催化工业上的应用。

a-L-AAD的最适温度；b-L-AAD温度稳定性；c-LaPPR的最适温度；d-LaPPR温度稳定性图2 温度对L-AAD和LaPPR的影响Fig.2 The influence of temperature on L-AAD and LaPPR

在不同反应pH下测定LaPPR酶活力，结果如图3-c所示，LaPPR的最适反应pH为7.0，在pH 7.0～8.0具有较高酶活力，当pH值低于7.0，酶活力迅速下降。图3-d中显示，在pH 7.0～8.0比较稳定，酶活力保持在80%以上，而偏酸性条件下，相对酶活力迅速降到40%以下，这表明在pH 7.0～8.0有较好的稳定性。本研究中使用的L-AAD和LaPPR具有良好的兼容性，为后续多酶级联奠定基础。

2.3 辅酶自循环体系的筛选及优化

2.3.1 辅酶自循环体系的优化

LaPPR催化PPA过程中需要消耗NADH，而NADH稳定性差，成本高[18]，在工业生产中添加昂贵的辅因子会大大增加生产成本，不符合绿色经济。辅酶再生是解决其价格昂贵的有效方法，现主要有葡萄糖脱氢酶和甲酸脱氢酶再生系统，通过分别催化葡萄糖和甲酸来再生NADH。

首先对来源于Lactobacillussp.CGMCC 9967的LaPPR转化能力进行验证，并对GDH和FDH进行筛选比较。20 mL的转化体系中包含PPA 10 g/L、1.5倍摩尔量的辅底物，分别加入LaPPR和GDH，以及LaPPR和FDH的粗酶液，并以LaPPR和原始菌株粗酶液组作为对照，各粗酶液在转化体系中的终浓度均为1 U/mL，转化反应于pH值为7.5， 220 r/min、30 ℃ 条件下进行[16]。结果如表2所示，通过比较两者酶活力以及计算其初始反应速率，GDH初始反应速率为16.16 mg/(L·min)，FDH初始反应速率为8.78 mg/(L·min)，因此选择GDH为下一步构建重组菌作铺垫。

2.3.2 LaPPR和GDH的酶量配比优化

在多酶级联催化反应中，酶的添加比例能够影响催化反应速率的平衡[20]。LaPPR和GDH作为参与还原反应中的重要酶，为了保证催化速率达到平衡，减少中间产物PPA积累，须对LaPPR和GDH的添加比例进行优化。

20 mL的反应体系中包含10 g/L的底物PPA，保持LaPPR终浓度为1 U/mL，GDH的添加量高于LaPPR，设定GDH与LaPPR不同添加比例，酶活力优化范围设定为1∶1～5∶1，按照不同添加比例催化底物，计算产物L-PLA的生成速率[16]。如图4所示，随着GDH的逐步增加，初始反应速率不断增加，当m(GDH)∶m(LaPPR)=4∶1时，初始反应速率达到最大值，为27.63 mg/(L·min)。

图4 LaPPR和GDH添加比例优化Fig.4 Optimization of dosage of LaPPR and GDH

2.4 共表达重组菌的构建及优化

按照方法1.2.2构建重组菌株E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh，超声破碎并离心，取上清液进行SDS-PAGE 分析，结果见图5，在约52.05、37、29.8 kDa位置处有明显的蛋白质特征条带，大小一致，各基因成功在大肠杆菌中表达。

M-蛋白质marker;1- E.coil BL21/pET-28a crude enzyme;2～4-E.coil BL21/pET-28a-laad-lappr-gdh图5 基因的表达及分析Fig.5 The result of gene expression and purification

利用上述共表达重组菌进行全细胞转化，结果如图6所示，当提供足够的Phe和葡萄糖时，底物Phe可大量被消耗，此时中间产物PPA大量积累，质量浓度达到27.89 g/L，而最终产物L-PLA产生速率较为缓慢。中间产物积累浓度较高，影响整个反应顺利进行。可能是由于LaPPR和GDH两个关键酶转化过程不平衡，从而影响PPA转化至L-PLA的催化速率。经酶活力测定，结果如表2所示，在重组菌中，LaPPR酶活力为12.89 U/mL，GDH为7.64 U/mL，GDH酶活力较低，从而影响反应使其不能相互协调，导致PPA不能被快速催化，造成中间产物的积累，影响L-PLA的生产。这一限速步骤对L-PLA产量的影响是亟需解决的问题。

图6 重组菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh全细胞转化合成L-PLAFig.6 The recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh whole cells catalyze the synthesis of L-PLA

2.5 限速步骤的解除

为了协调具有一个载体的共表达菌株中LaPPR和GDH的表达水平，通过对LaPPR和GDH的表达量进行调节优化，增加GDH的拷贝量，其酶活力情况如表2所示。通过调节级联全细胞生物催化剂中酶的表达，当GDH为2个拷贝量时，中间产物PPA的积累减少，减少了84.60%，L-PLA产量有较大的提高，产量增加了3倍多。

表2 LaPPR、FDH及GDH在大肠杆菌中的酶活力 单位：U/mL

2.6 重组菌全细胞转化合成L-PLA的条件优化

2.6.1 温度对全细胞转化合成L-PLA的影响

反应体系的温度会直接影响酶的催化活性和稳定性[15]，从而影响最终产物PLA的产量。例如L-AAD和LaPPR最适反应温度分别为37、30 ℃，为了能够达到最佳的转化效果，需要对转化的温度进行优化。控制初始反应pH值为8.0，底物质量浓度30 g/L，菌体量OD600为30，辅底物葡萄糖1倍摩尔当量，在不同温度(25～45 ℃)下进行全细胞转化反应。

如图7-a所示，温度为30 ℃时，L-PLA产量达到最高，20.24 g/L，转化率为67.49%，而当温度增加到45 ℃时，L-PLA产量显著下降，说明此时某种酶活力受到影响，无法维持反应的进行。

2.6.2 初始pH对全细胞转化合成L-PLA的影响

在多酶催化反应体系中，pH通过影响菌体状态和酶促反应的效率而影响L-PLA的合成，例如L-AAD和LaPPR最适反应pH值分别为8.0和7.0，为了使反应高效进行，对转化初始pH进行了优化。维持反应温度30 ℃，底物质量浓度30 g/L，菌体量OD600为30，辅底物葡萄糖1倍摩尔当量，在初始反应体系pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0条件下进行全细胞转化反应。

如图7-b所示，随着pH的升高，L-PLA产量增加，且8.0时达到最高21.02 g/L，转化率为70.09%，偏碱性环境可以实现3种酶的良好催化。

2.6.3 菌体量对全细胞转化合成L-PLA的影响

实际应用中为了满足生产效率和降低生产成本，控制菌体浓度在适宜范围内也是至关重要的。控制初始反应pH值为8.0，反应温度30 ℃，底物质量浓度30 g/L，辅底物葡萄糖1倍摩尔当量，菌体OD600为10～50，进行催化反应。

如图7-c所示，转化体系菌体OD600为30时，L-PLA产量达到最高，为21.20 g/L，转化率为70.66%。

2.6.4 底物浓度对全细胞转化合成L-PLA的影响

为了提高L-PLA的产量，在前期优化的最佳转化条件下(温度30 ℃，初始pH值为8.0，菌体量OD600，辅底物葡萄糖添加量为1倍摩尔当量)合成L-PLA，底物Phe质量浓度分别为10、20、30、40、50 g/L 进行催化反应。

如图7-d所示，底物质量浓度为30 g/L时，产量达到最大值，为21.36 g/L，转化率为71.22%，当底物质量浓度为50 g/L时，转化率也能维持在40.29%左右。可能由于Phe溶解度低，反应体系中还有其他物质，体系无法承载过多底物，从而产量有所下降[19]。

2.6.5 辅底物与底物比例对全细胞转化合成L-PLA的影响

葡萄糖在GDH作用下生成辅酶NADH，随着NADH的增加，重组菌合成L-PLA产量越高，对反应体系中葡萄糖的添加量进行了优化。控制反应温度30 ℃，初始反应pH值为8.0，菌体量OD600为30，底物Phe质量浓度30 g/L，添加0、0.5、1、1.5、2、2.5倍摩尔当量的葡萄糖进行全细胞催化。

如图7-e示，未添加葡萄糖时，由于大肠杆菌本身含有一定的辅酶NADH，但不能支撑整个反应的进行，可生成少量L-PLA。当葡萄糖添加量为1、1.5、2、2.5倍摩尔当量时，L-PLA产量无明显差异变化，表明辅底物添加量≥1倍摩尔量时即可满足反应需求，选择葡萄糖添加量为1倍摩尔当量最为合适。

a-温度；b-初始pH；c-菌体浓度；d-底物浓度；e-辅底物添加量图7 转化条件对重组菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh全细胞转化合成L-PLA的影响Fig.7 Effect of transformation conditions on the transformation and synthesis of L-PLA by recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh

2.7 1 L放大全细胞转化L-PLA

为利用重组大肠杆菌E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh高效转化生产L-PLA，按照上述优化后全细胞催化条件研究重组菌在大体系中的转化水平。用1 L 0.1 mol/L 的PB缓冲液悬浮菌体，控制反应温度30 ℃，初始pH值为8.0，底物Phe 30 g/L，甘油2.5 mol/L，辅底物葡萄糖1倍摩尔当量，菌体OD600为30的条件下进行转化，液相检测转化液中各组分含量情况。

如图8所示，30 g/L底物质量浓度下，共生成21.39 g/LL-PLA，转化率为71.33%。反应后期延长转化时间，转化率变化不明显，可能是反应趋于平衡。

图8 重组菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh全细胞转化合成L-PLAFig.8 The recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh whole cells catalyze the synthesis of L-PLA

3 结论与讨论

本研究通过构建高效便捷的多酶级联催化体系，利用重组大肠杆菌全细胞催化Phe合成L-PLA。首先分别对L-AAD和LaPPR分别进行酶学性质研究，以此为基础筛选比较构建辅酶自循环体系，解决中间产物积累问题，从而实现Phe到L-PLA的直接转化，最终产量达到21.39 g/L，摩尔转化率为71.33%。然而本研究所制备的产量仍有提升空间，导致产量无法进一步提高的原因是由于Phe溶解度低，反应体系无法承载过多底物，且有结晶存在，因此转化率无法进一步提高，增加了转化体系的传质阻力[21]，同时影响酶的催化特性。本研究提供了一种新型的L-PLA合成途径，因PPA价格较高，由Phe为底物，大大减少了生产成本，缩短了工艺流程，采用全细胞催化合成L-PLA，操作工艺便捷，转化效率高。对提供挖掘成本低廉并能高效转化的生物催化合成L-PLA的方法具有借鉴作用，同时对其在食品及合成药物行业生产具有广泛的指导意义。