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土大黄内生真菌L10的培养条件优化

2018-11-30卢甜甜郑双芝柴家乐李晓菡陈怡怡吴丹丹白雪莲

农产品加工 2018年21期
关键词:锥形瓶菌体内生

卢甜甜,郑双芝,柴家乐,李晓菡,陈怡怡,吴丹丹,白雪莲

(杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江杭州 310016)

土大黄,别名红筋大黄、金不换、血三七、化雪莲、鲜大青,为蓼科酸模属植物,主要分布在我国的浙江、四川、贵州、江苏、福建、湖南等地。根和叶可以入药,具有清热解毒、止血、祛瘀、通便、杀虫等功效。秋季挖根,洗净、切片,晒干或鲜用。10月份采叶,随用随采[1]。

内生菌是指在其生活史的一段或全部阶段,生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的微生物[2]。研究表明,内生菌与病原菌在植物体内相互竞争空间、营养,使病原菌得不到正常的营养供给而消亡,从而增强宿主抵御病害的能力[3]。

项目组前期从土大黄植株中分离获得86株内生菌,经抑菌活性筛选,发现内生菌L10代谢产物抑菌活性强,具有极大的开发应用价值,因此对土大黄内生真菌L10的培养条件进行优化,以期为今后深入研究土大黄内生真菌L10的代谢产物和大规模发酵奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株:土大黄内生真菌L10,杭州师范大学微生物实验室提供;马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基(PDB)、盐酸、氢氧化钠,国药集团提供。

1.2 方法

1.2.1 菌体干质量测量方法

以菌体干质量为指标,即取1 mL菌液加入离心管,以转速8 000 r/min离心10 min,去掉上清液,菌体在105℃条件下烘至恒质量即为菌体干质量。

1.2.2 孢子悬浮液的制备

将内生真菌L10接种到PDA固体培养基上,于28℃下培养7 d,每个培养皿中分别加入2 mL无菌水,用无菌接种环轻轻刮取菌落表面,用移液器吸取培养基表面孢子悬液加入锥形瓶中,各培养皿在一个锥形瓶中混匀,备用。

1.2.3 单因素试验

(1)培养基初始pH值对菌体干质量的影响。在250 mL锥形瓶中接入3 mL孢子菌悬液,再加入97 mL PDB液体培养基,用盐酸溶液、氢氧化钠溶液分别调节 pH值至 5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,在 28℃,200 r/min摇床上培养7 d。

(2) 接种量对菌体干质量的影响。在250 mL锥形瓶中分别接入2.5,5.0,10.0,15.0,20.0 mL孢子菌悬液;再依次加入97.5,95.0,90.0,85.0,80.0 mL PDB液体培养基,pH值自然,在28℃,200 r/min摇床上培养7 d。

(3) 培养温度对菌体干质量的影响。在250 mL锥形瓶中接入3 mL孢子菌悬液,再加入97 mL PDB液体培养基,pH值自然,分别设置温度为15,20,25,30,35℃,在200 r/min摇床上培养7 d。

(4)装液量对菌体干质量的影响。在250 mL锥形瓶中分别接入1.5,3.0,4.5 mL孢子菌悬液,再依次加入48.5,97.0,145.5 mL PDB液体培养基,pH值自然,在28℃,200 r/min摇床上培养7 d。

1.2.4 Box-Behnken优化试验

在单因素试验的基础上,选择培养温度、接种量、装液量3个因素为主因子,按照Box-Behnken试验设计安排试验,以菌体干质量为评定指标。试验所得数据整理后,用Design Expert 10.0软件进行分析处理。

Box-Behnken试验设计因素与水平设计见表1。

2 结果与分析

2.1 培养条件对菌体生长的影响

2.1.1 培养基初始pH值对菌体生长的影响

菌种只有在适宜的pH值条件下才能良好生长,pH值过高或者过低都不利于菌种的生长。

培养基初始pH值对菌体生长的影响见图1。

由图1可知,菌体干质量随着初始pH值的升高呈先增大后减小的趋势。当pH值为7.0时,菌体干质量最大,达到2.58 g/L;当pH值达到7.5时,菌体的干质量下降为2.42 g/L;培养基的自然pH值是6.8,接近于pH值的最适值。所以,无需对培养基的pH值进行调整,即可达到较高的菌体生长水平。2.1.2 接种量对菌体生长的影响

接种量与菌体总量成正比,接种量越大,菌体的调整期越短,而菌体总量越大;但是,受培养基中营养物质和反应器体积的限制,分批培养能达到的菌体总量有限,接种量增大至一定程度时,不但对菌体生长无益,而且容易造成菌体的老化和自溶。

接种量对菌体生长的影响见图2。

由图2可知,从2.5%~10.0%,随着接种量的增加,菌体干质量从1.78 g/L到4.83 g/L逐渐增大;当接种量大于10.0%时,接种量继续增大对菌体生长无显著影响。

2.1.3 培养温度对菌体生长的影响

菌种生长有各自适宜的温度,超出这一范围将不利于菌种生长。

培养温度对菌体生长的影响见图3。

由图3可知,在30℃条件下,菌体干质量达到最大为2.17 g/L;在25℃条件下,菌体干质量与最大菌体干质量无显著差异;而在其他温度条件下,菌体干质量显著降低。因此25~30℃比较适宜菌种的生长。

2.1.4 装液量对菌体生长的影响装液量越大,则菌体生长所需的营养物质越多。装液量对菌体生长的影响见图4。

由图4可知,菌体干质量在装液量为100 mL时最大为2.1 g/L;在装液量为150 mL时,菌体干质量下降。

2.2 菌体生长条件的优化

根据单因素试验结果,采用Box-Behnken模型选择接种量X1、培养温度X2、装液量X3设计三因素三水平设计优化试验。

试验方案及结果见表2,回归模型的方差分析见表3。

表2 试验方案及结果

利用Design Expert 10.0统计软件对表2数据进行多元回归拟合,得到菌体干质量(Y)的多元回归模型为:

模型复相关系数R=0.994,决定系数R2=0.986 2,显著性检验表明回归模型极显著,各因素对Y均有显著影响(表3),模型有意义。模型中各因素的回归系数显著性检验结果(表3) 表明,接种量X1、培养温度X2、装液量X3对菌体干质量影响均为极显著,接种量与培养温度、接种量与装液量两两之间交互作用影响显著。

表3 回归模型的方差分析

利用复合函数极值法进一步分析表明,当X1=0.59,X2=0.08,X3=0.32,接种量为13%,培养温度为28℃,装液量为125 mL时,菌体干质量有最大预测值,为5.162 g/L。为验证模型的有效性,用优化得到的培养条件进行试验(重复3次),测得实际菌体干质量为5.126 g/L,与预测产量之间没有显著性差异,达到优化前培养条件(250 mL锥形瓶装液100 mL,接种量3%,培养温度28℃) 菌体干质量(约2.5 g/L) 的2.4倍。

3 结论

试验有效地优化了土大黄内生真菌L10的培养条件。在单因素试验的基础上,用Box-Behnken模型对土大黄内生真菌L10的液体培养条件进行了优化,菌体干质量从优化前的2.5 g/L提高到优化后的5.126 g/L,约为优化前2.4倍。

所得内生菌L10培养条件为其产生最佳代谢产物奠定了基础,其代谢产物的相关研究需进一步展开。此外,培养基组成对菌体生长影响很大,在此基础上还可以进一步优化培养基配方,使菌体生长代谢能力得到进一步提高。

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