谢 晨，熊泽语，李 慧，金素莱曼，陈百科，包海蓉,2,3,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306）

大黄鱼（Pseudosciaena crocea）因其年产量高、味道鲜美、鱼肉内细鱼骨较少、便于食用而深受消费者青睐，是消费者摄取蛋白质和不饱和脂肪酸等营养物质的优质来源之一[1]。但由于大黄鱼有较高的脂肪酸含量且内源酶活性强，再加上环境中和鱼肠道中微生物的作用，如果不储存于低温环境中，则极易产生腐败。因此保持产品捕捞后的新鲜度并延长货架期对大黄鱼产业是至关重要的。

微冻是将待保藏的产品温度降至稍低于细胞汁液冻结点的温度下，使之处于部分冻结状态下的一种保藏方法[2]。微冻可以通过冻结鱼体部分水，升高未冻结部分的渗透压来抑制微生物生长[3]，从而延长食品保质期。与冰藏相比，微冻极大地延长了水产品的货架期，延缓微生物的繁殖增长，同时，微冻对水产品蛋白质冷冻变性的影响没有冷冻贮藏那么严重。可以说，微冻是一种在短期内保持捕捞后水产品品质的较好方法。

为了更好地保持水产品品质，除了选用多种低温贮藏方式来维持水产品捕捞后的鲜度，各种保鲜剂也常常被利用于水产品的保鲜中。生物保鲜剂是从动植物中提取或通过微生物发酵产生的天然活性物质，是目前保鲜剂研究开发的热点。国内外研究人员已发现了多种动植物提取物能有效延缓水产品变质，如茶多酚[4]、海藻酸钠[5]、海藻糖[6]、葡萄籽提取物[7]等。金针菇多糖（polysaccharide fromFlammulina velutipes，FVP）[8]是从金针菇子实体中提取出的水溶性多糖，主要由甘露糖和木糖组成。目前对FVP的研究主要集中在体外自由基清除能力[9]、免疫调节能力[10]的测定。Kawahara等[11]通过冷热台显微镜发现FVP溶液具有冰重结晶抑制能力和热滞活性，表明FVP可作为抗冻保鲜剂使用。但目前FVP在水产品抗冻保鲜方面的应用研究鲜有报导。为了研究FVP对大黄鱼及其鱼片的保鲜效果，将两者用不同质量浓度FVP浸渍处理，探究FVP对微冻大黄鱼感官指标、巯基含量、Ca2＋-ATPase活性、流变学特性以及水分迁移情况，旨在为FVP在水产品保鲜应用方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜大黄鱼，体质量为（500±50）g，购于福建宁德蔡氏水产有限公司，夜间捕捞，加冰置于泡沫箱内，在4 ℃下经13 h运输至实验室进行实验处理。

酒石酸钾钠、氯化钾、磷酸氢二钠、轻质氧化镁、浓硫酸、ATP、5,5’-二硫代双（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、三氯乙酸、硼酸、曲拉通）、钼酸铵、甲基红/蓝、Tris试剂、牛血清白蛋白、硫酸亚铁、体积分数95%乙醇溶液、氯化钠、浓盐酸、无水硫酸铜等（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004型电子天平 南京东迈科技仪器有限公司；SG2 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；D-130电动匀浆机 维根技术（北京）有限公司；Kjeltec8400型凯氏定氮仪 丹麦FOSS有限公司；LRH-100CL低温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；MCR301流变仪 安东帕仪器（上海）有限公司；MesoMR23-060H.I低场核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）成像分析仪 上海纽迈电子科技有限公司；GL-20B高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；UV1100型紫外-可见分光光度计 广州罡然机电设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

金针菇洗净、冻干、碾成粉末，取50 g金针菇粉末，用600 mL质量分数2% KOH溶液于100 ℃浸泡提取2.5 h后，10 000 r/min离心15 min，收集上清液，重复浸提3 次，合并上清液，约得到1 780 mL上清液，于55 ℃下旋转蒸发浓缩至250 mL。在浓缩液中加乙酸中和至pH 7.0，加入4 倍体积的无水乙醇，使浓缩液产生沉淀，沉淀用无水乙醇清洗，除去不溶性物质，并参照文献[11]进行透析和纯化，得到FVP。

将新鲜大黄鱼随机分成两组，一组除去皮、鳞、内脏、鱼骨，取完整背部肌肉片成5 cm×3 cm×1 cm大小的鱼片，另一组不作处理，将两组样品分别置于0.03、0.06、0.09 g/L的FVP溶液中浸渍10 min，并以无菌水处理作为对照。样品沥水后装入自封袋中，于－3 ℃冰箱中微冻贮藏（大黄鱼冰点－1.5 ℃），在0、4、8、12、16 d随机抽样进行相关指标测定。

1.3.2 感官分析

根据SC/T 3101—2010《鲜大黄鱼、冻大黄鱼、鲜小黄鱼、冻小黄鱼》[12]以及GB/T 18108—2019《鲜海水鱼通则》[13]对大黄鱼鱼肉进行感官分析。由5 名评价人员（进行了3 h不同新鲜度大黄鱼感官评价的实物培训，评价人员年龄段为22～25 岁，2男3女）对鱼肉色泽、弹性、气味进行综合评价。满分5 分，去掉1 个最高分和1 个最低分后计算平均值，代表样品最终评分，具体标准见表1。

表1 大黄鱼鱼肉感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Pseudosciaena crocea

1.3.3 总挥发性盐基氮含量的测定

总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的测定参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[15]，使用全自动凯氏定氮仪测定样品TVB-N含量/（mg/100 g），每组样品测定3 次。

1.3.4 肌原纤维蛋白提取

参照Katoh等[14]的方法提取肌原纤维蛋白，整个蛋白提取过程在冰浴中进行。向5 g鱼肉中加入40 mL蛋白提取液（含40 mmol/L Tris-马来酸、0.16 mol/L KCl、1%体积分数的曲拉通，pH 7.5），10 000 r/min均质2 min，4 ℃、5 000 r/min离心15 min，取沉淀加入40 mL蛋白提取液（含40 mmol/L Tris-马来酸、0.16 mol/L KCl，pH 7.5），重复上述步骤两次得粗蛋白。将粗蛋白与20 mL 0.1 mol/L KCl混合，均质、离心（步骤同上）。再加入40 mL 0.1 mol/L KCl均质，用两层纱布过滤后离心，沉淀即为肌原纤维蛋白。以牛血清白蛋白作标准曲线，用双缩脲法测定蛋白浓度，并用0.6 mol/L KCl配制成所需浓度肌原纤维蛋白溶液，置于4 ℃冰箱冷藏待用。

1.3.5 总巯基含量测定

依据di Simplicio等[16]的方法使用DTNB进行测定，取1 mL 2 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液加入9 mL 50 mmol/L的磷酸缓冲液，取4 mL混合液加入0.4 mL pH 8.0含质量分数1% DTNB的0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液，40 ℃水浴25 min，在412 nm波长处测定吸光度A412nm。按照公式（1）计算总巯基含量。

1.3.6 Ca2＋-ATPase活力测定

参考Benjakul等[17]的方法进行测定大黄鱼Ca2＋-ATPase活力，结果以1 mg肌原纤维蛋白每分钟生成无机磷物质的量表示。无机磷标准曲线的绘制方法如下，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 0.001 mol/L Na2HPO4，加蒸馏水使总体积为2.9 mL，然后加入0.1 mL质量分数15%的三氯乙酸和2 mL硫酸亚铁-钼酸铵溶液（10 mL 10%质量分数的钼酸铵硫酸溶液（硫酸浓度为5 mol/L）加5 g硫酸亚铁定容到100 mL），25 ℃水浴5 min，测定660 nm波长处的吸光度A660nm，得到无机磷标准曲线：无机磷物质的量/μmol＝（A660nm－0.001 3）/0.640 9。

取3.5 mL质量浓度2 mg/mL肌原纤维蛋白溶液加入0.3 mL pH 7.0 0.5 mol/L Tris-马来酸缓冲溶液和0.5 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液，再加入0.25 mL 20 mmol/L ATP，25 ℃水浴10 min后加入2.5 mL质量分数15%的三氯乙酸，4 ℃、5 000 r/min离心5 min。取0.5 mL上清液加入2.5 mL蒸馏水，混匀后加2 mL硫酸亚铁-钼酸铵溶液（配制方法同上），25 ℃静置1 min，在660 nm波长处测定吸光度。空白组中先加三氯乙酸，再加ATP。将测得的吸光度代入无机磷标准曲线算出相应的无机磷物质的量，然后按照公式（2）计算Ca2＋ATPase活力。

式中：n为生成的无机磷物质的量/μmol；t为反应时间/min；m为肌原纤维蛋白质量/mg。

1.3.7 流变学性质测定

参考邹咪等[18]的方法进行温度扫描，将提取出的肌原纤维蛋白用0.6 mol/L KCl配制成质量浓度10 mg/mL蛋白溶液，选用DG26.7型号探头，设置角频率1 rad/s，应变为1%，升温速率为1 ℃/min，每次进样5 mL，测定样品从20～80 ℃的弹性模量（G’）变化。

1.3.8 水分迁移变化的低场核磁共振和核磁成像分析

参考Wang Shuo等[19]的方法，将解冻后大黄鱼背部肌肉切成2 cm×2 cm×1 cm鱼块，用保鲜膜包裹进行LF-NMR分析，使用Carr-Purcell-Miniboom-Gill（CPMG）程序，核磁管宽度为60 nm，质子共振频率21 MHz，累加次数4，采样频率100 kHz，迭代反演后得到弛豫时间T2图谱，不同状态水分相对含量以其对应峰面积比例表示，并使用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）软件进行成像，并将图像进行伪彩处理。

1.4 数据处理与分析

采用Origin 8.0、Excel软件进行图像绘制，SPSS 23软件进行数据分析。数据分析使用单因素方差分析中的Duncan模型，P＜0.05表示数据间有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 感官分析结果

感官分析是消费者对产品的直观判断，产品在感官上是否可接受很大程度上决定了消费者的购买意愿。感官变化通过对鱼肉的色泽、气味、弹性3 个方面进行分析，具体结果见图1。

图1 FVP对微冻大黄鱼整鱼及鱼片感官得分变化的影响Fig. 1 Effect of FVP on the change in sensory evaluation scores of whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage

微冻贮藏前期，大黄鱼的鱼肉色泽鲜亮，肌肉坚实而有弹性，并带有清新的海鱼味。随着贮藏时间的延长，鱼肉逐渐失去光泽，腥味加重，肌肉失去弹性，这使得大黄鱼整鱼及鱼片的感官得分均有所下降。但整鱼和鱼片两者的主要感官影响因素略有不同。对鱼片来说，鱼肉的颜色由鲜亮变得发黄、暗淡，干耗使鱼片表面水分含量减少，加速了氧化反应，这是主要的感官得分影响因素，气味和弹性两者的变化差异并不是很大。而整鱼的主要减分项为气味和弹性。微冻后期，未经FVP处理的大黄鱼腥味较重，且带有一点腐败味，FVP处理过的鱼腥味较小。整鱼鱼肉的质地变得柔软无弹性，没有同时期鱼片的鱼肉紧实。第16天时发现，整鱼对照组的部分内脏已经开始溶解，即鱼已经进入腐败阶段。总体而言，微冻末期，鱼片总体仍在感官可接受范围内，整鱼对照组感官上已经难以接受，随着FVP处理浓度增加，接受程度有所上升。

2.2 TVB-N含量分析结果

TVB-N是鱼肉中蛋白质等含氮物质因酶和微生物的分解利用产生的挥发性含氮物质，TVB-N含量可用于判断原料鱼的新鲜程度。据SC/T 3101—2010《鲜大黄鱼、冻大黄鱼、鲜小黄鱼、冻小黄鱼》，TVB-N含量≤13 mg/100 g为一级鲜度，13 mg/100 g＜TVB-N含量≤30 mg/100 g为二级鲜度[12]。

由图2可知，样品TVB-N含量前期变化较为缓慢，后期迅速上升。微冻0～4 d，鱼片、整鱼组TVB-N含量略有增加，但无明显差异。微冻4 d之后各组TVB-N含量开始出现差异。鱼片组微冻第16天时，对照组TVB-N含量最高，经0.09 g/L FVP处理的样品TVB-N含量最低，经0.03、0.06 g/L FVP处理的鱼片间TVB-N含量差异不明显。微冻16 d时整鱼组的TVB-N含量各组之间的差异较鱼片组更大，TVB-N含量与FVP浓度呈负相关，这表明FVP能有效延长大黄鱼处于一级鲜度的时间。在第12天整鱼组基本到达二级鲜度，而鱼片组仍全部为一级鲜度，后续两组的鲜度差异逐渐增大。研究表明，海水鱼的腐败主要受到微生物、酶和氧化作用的影响[20]。FVP具有自由基清除能力，可能通过抑制脂肪和蛋白的氧化使得样品TVB-N含量低于对照组。贮藏过程中鱼肠道内的微生物侵入机体，不断分解蛋白质等营养物质，生成组胺、醛类等不良风味物质[21]。此外，鱼的内脏和肌肉中存在大量内源酶，这些酶进入肌肉后导致鱼体组织软化降解，也常伴随产生甲醛、乳酸等不良风味物质[20]。鱼片组去除了鱼体内的内脏、肠道等含大量微生物、内源酶的部分，只含肌肉组织，因此腐败程度较整鱼组低。

图2 FVP对微冻大黄鱼整鱼及鱼片TVB-N含量变化的影响Fig. 2 Effect of FVP on the change in TVB-N content in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage

2.3 总巯基含量分析结果

总巯基含量是活性巯基含量与隐藏巯基含量的总和，蛋白的冷冻变性造成蛋白三维空间结构发生变化，蛋白分子内部的活性巯基被暴露从而氧化，使总巯基含量下降，总巯基含量是反映蛋白氧化程度的指标之一[22]。微冻过程中，大黄鱼整鱼和鱼片总巯基含量的变化如图3所示，随着贮藏时间的延长，鱼片组和整鱼组总巯基含量都呈下降趋势。微冻16 d时，鱼片组对照、0.03、0.06、0.09 g/L FVP处理组总巯基含量分别为初始值的33.93%、36.19%、39.19%、40.74%，整鱼组对照、0.03、0.06、0.09 g/L FVP处理组总巯基含量分别为初始含量的37.41%、39.41%、42.37%、43.83%。由此可知，FVP可以在一定程度上抑制总巯基含量的下降。巯基含量的下降是肌动球蛋白头部结构的改变使巯基暴露而被氧化为二硫化合物造成的，因此总巯基含量的降低常伴随着二硫键含量的升高[22]。此外，巯基的氧化还与样品贮藏温度有关，样品贮藏温度越低，总巯基含量下降的越慢[23]。

图3 FVP对微冻大黄鱼整鱼及鱼片总巯基含量变化的影响Fig. 3 Effect of FVP on the change in total sulfhydryl content in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage

2.4 Ca2＋-ATPase活力分析结果

Ca2＋-ATPase活性来源于肌球蛋白头部结构，是常用来表示肌球蛋白分子完整度的指标，广泛用于评价肌原纤维蛋白变性的程度[24]。可以根据单位时间内ATPase催化ATP分解生成的无机磷酸含量来判断大黄鱼的Ca2＋-ATPase活力。微冻期间样品肌原纤维蛋白Ca2＋-ATPase活力的变化情况如图4所示。可以看出，在－3 ℃条件下贮藏的黄鱼肌原纤维蛋白，其Ca2＋-ATPase活力呈现下降的趋势，不同浓度FVP处理的样品间存在明显差异。总巯基含量的下降会影响Ca2＋-ATPase活力，将2.3节总巯基含量与不同贮藏时间对应的Ca2＋-ATPase活力进行相关性分析，结果见表2，分析结果证实两者存在极显著相关性（P＜0.01）。根据巯基温度越高越容易氧化的特点，降低贮藏温度可以有效延缓Ca2＋-ATPase活力的下降。

图4 FVP对微冻大黄鱼整鱼及鱼片Ca2＋-ATPase活力的影响Fig. 4 Effect of FVP on the Ca2+-ATPase activity in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage

表2 微冻大黄鱼整鱼及鱼片总巯基含量和Ca2＋-APTase活力的相关性分析Table 2 Correlation analysis between total sulfhydryl content and Ca2+-ATPase activity in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage

2.5 肌原纤维蛋白流变特性分析结果

肌原纤维蛋白受热生成凝胶是一个伴随着蛋白解链、变性、聚集的不稳定的过程。肌原纤维蛋白流变学特性中的G’是蛋白凝胶因弹性形变而产生的能量变化，是反映肌原纤维蛋白聚集、交联的指标[25]。G’越高，蛋白凝胶弹性越强。本实验研究了与温度有关的大黄鱼肌原纤维蛋白流变学性质的变化规律。

如图5所示，整鱼和鱼片组G’的变化趋势大致为先上升后下降最后再上升。在20～80 ℃的加热过程中，大黄鱼的肌原纤维蛋白的G’变化可分成3 个阶段。第一阶段在20～41 ℃之间，肌原纤维蛋白溶胶初步形成较弱的凝胶网络结构，在20～36 ℃之间G’变化缓慢，36～41 ℃之间快速上升。当温度在41～44 ℃之间时，G’急剧下降，这是由于肌原纤维蛋白发生热变性，之前形成的弱网络结构被破坏，为凝胶劣化阶段，G’降低。而温度在44～80 ℃为凝胶强化阶段，G’再次上升，肌原纤维蛋白由于共价二硫键和疏水相互作用，形成了稳定的三维网络结构[26]。

图5 FVP对微冻大黄鱼整鱼及鱼片肌原纤维蛋白溶液G’的影响Fig. 5 Effect of FVP on the G’ of myofibrillar protein in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage

肌原纤维蛋白温度扫描测得的G’变化普遍表现为上升、下降、上升的趋势，但不同动物来源的肌原纤维蛋白的转变温度差异很大[27]。李可等[28]发现鸡肉的G’在第一次上升时的温度区间为22～51 ℃，下降时的温度区间为51～57 ℃，鸡肉的转变温度远高于大黄鱼的转变温度，李长乐等[29]发现鲣鱼蛋白G’的两个转变温度分别为38 ℃和47 ℃。这说明肌原纤维蛋白在加热过程中聚集和交联形成一个有序的凝胶网络结构，这种变化存在种特异性[30]，即使同为海水鱼，不同种鱼的肌原纤维蛋白G’的转变温度也有很大差异。在本实验中，整鱼和鱼片组G’最大值随微冻时间的延长有所降低，整体曲线随FVP处理浓度的增加而上移。但FVP的添加并未对大黄鱼整鱼和鱼片肌原纤维蛋白的转变温度产生明显影响，肌原纤维蛋白的两个转变温度始终保持在41、44 ℃左右。

2.6 水分迁移变化的LF-NMR和MRI分析结果

鱼体内水分存在形式的变化对蛋白的冷冻变性有极大影响。水在鱼肉中以自由水、不易流动水和结合水3 种形式存在。微冻过程中，自由水先形成冰晶，随着温度进一步下降，结合水也发生冻结，蛋白内部化学键发生断裂，并形成新的氢键、二硫键等，这使得蛋白空间结构发生不可逆变化而变性[31]。因此对鱼肉水分的研究也是控制水产品品质的重要一环。LF-NMR是一种利用氢原子核在磁场中的弛豫特性来确定原料肉中水分分布状态的快速、无损的检测技术。通过横向弛豫时间T2来区分原料肉中不同状态的水分。T2越大表示水分子的自由度越高，水分子与其他分子结合越松散。大黄鱼LF-NMR的弛豫信号曲线可分为3 个部分：结合水（T2b）（0～10 ms）、肌膜与肌纤维之间的不易流动水（T21）（10～200 ms）、肌纤维之外的自由水（T22）（200～1 500 ms）。

如图6所示，新鲜鱼肉中主要为不易流动水，自由水和结合水相对含量很低。微冻过程中，整鱼和鱼片均显示不易流动水相对含量逐渐减少，自由水逐渐相对含量增加的趋势，而结合水的相对含量略有减少，这是因为鱼肉在微冻过程中肌原纤维蛋白结构被破坏而变得松散，肌纤维保水能力降低，不易流动水逐渐转化为自由水。FVP处理后的鱼片和整鱼较对照组水分流失现象更轻。可能是由于糖类含有大量羟基，可以与鱼中的水分子结合，使得共晶点温度降低，抑制水分形成冰晶，从而抑制蛋白变性[32]。与整鱼相比，鱼片的水分流失更严重，可能是由于鱼片肌肉没有像整鱼那样有鱼鳞和鱼皮阻隔，鱼肉表面生成的冰晶在微冻过程中升华，长期冷冻使鱼片因干耗而损失大量水分。FVP在鱼片表面形成了一层多糖膜，可以截留更多的水分。

MRI成像如图7所示，颜色越鲜红表明1H质子密度越高，水分质量分数越高，蓝色表明含水量低。图片颜色的变化可以反映鱼肉水分分布情况。图7结果与图6基本一致。鱼肉从第0天的鲜红色逐渐转变为橙黄色再到黄中带蓝色，不易流动水逐渐转化为自由水流出，蓝色越多，水分流失率越高。

图6 FVP对微冻大黄鱼及鱼片中不同状态水分相对含量的影响Fig. 6 Changes in the percentage of T2i in whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea pretreated with FVP during superchilled storage

图7 FVP对微冻大黄鱼及鱼片MRI变化的影响Fig. 7 Effect of FVP on the change in nuclear magnetic resonance images of whole fish and fillets of Pseudosciaena crocea during superchilled storage

3 结 论

本实验研究了不同浓度FVP浸渍对微冻大黄鱼及鱼片感官得分、TVB-N含量、总巯基含量、Ca2＋-ATPase活力、流变特性及鱼肉水分分布状态的影响。结果表明，整鱼由于微生物和酶的作用，感官劣变和TVB-N含量升高较鱼片变化更明显；鱼片由于贮藏过程中的干耗作用，肌肉的持水性没有整鱼好。FVP可以延缓鱼肉的腐败，微冻16 d后整鱼对照组TVB-N含量约为0.09 g/L FVP处理组TVB-N含量的1.5 倍，鱼片组腐败没有整鱼组严重，TVB-N含量的差异不明显。FVP还可以通过形成多糖膜来降低鱼片水分流失。通过肌原纤维蛋白的总巯基含量、Ca2＋-ATPase活性和温度扫描分析得出FVP处理后鱼肉蛋白稳定性较对照组强，其中0.09 g/L处理组效果最好。本研究证明不同浓度FVP对大黄鱼及其鱼片均有一定保鲜作用，0.09 g/L的FVP处理可使大黄鱼整鱼TVB-N含量在一级鲜度范围的时间延长2 d左右。因此，FVP可作为水产品生物抗冻保鲜剂使用。