赵卿宇，林佳慧，沈 群

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，植物蛋白与谷物加工北京市重点实验室，国家果蔬加工工程技术研究中心，北京 100083）

大米是亚洲许多国家的主食，并且其在欧美国家中也逐渐成为重要的谷物来源[1]。由于大米生长的季节性以及消费的连续性，新收获大米必须在后续加工之前储存。储存的大米不仅可保障工业生产和消费者食用的全年供应，而且还可以预防在不可预测情况下的饥荒[2]。据国家粮食和物资储备局统计，2014—2019年中国的大米库存由1.34亿 t增加到2.45亿 t[3]。中国大米的主产地包括东北地区和淮海地区，这些地区生产的大米约占全国总产量的59.6%[4]。除了用于本地区消费外，每年都有大量的大米需要跨地区运输。中国东北地区每年有超过400万 t的粳米运往省外，占据中国大米跨省运输量的35%以上。大米的运输方式主要有海运、铁路运输、公路运输、铁水联运和公水联运，其中85%运输方式涉及集装箱运输。一般集装箱运输过程需要2～10 个月，其中海运过程中集装箱内部温度甚至可能达到70 ℃以上[5]。

目前关于大米陈化的品质研究大多与淀粉和脂肪相关[6-7]。然而蛋白质是大米中含量仅次于淀粉的营养物质，不同品种大米中含有8%～13%的蛋白质。大米蛋白以其高营养、低致敏性、多功能的特点被业界认可并广泛添加于食品中。蛋白质的功能特性指的是在食品加工、烹调、储藏过程中，在环境作用下，其所具有的物理化学性质。蛋白质功能特性受多种因素影响，例如提取方法、样品处理方法、pH值、食品中盐和糖的浓度以及食品中存在的其他成分（例如碳水化合物和脂质）[8]。现阶段对大米蛋白功能特性的研究主要集中在电子束辐照[9]、射频处理[10]、热稳定处理[11]、加工改性[12]等方面，而储藏研究则主要针对米糠球蛋白[13]、籼米谷蛋白[14]等组分蛋白上，缺乏对不同大米蛋白功能特性的系统研究。本课题组早期已对东北地区3 个重要大米品种（‘稻花香二号’‘辽星’和‘盐丰’）开展了理化、风味、质构特性、蒸煮特性以及糊化特性等研究[15-17]。基于此，本实验以大米蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性为指标，分析其在4、30 ℃和70 ℃储存10 个月过程中的变化情况，探究储藏温度对不同品种大米蛋白功能特性的影响，旨在为优质大米储藏过程中蛋白品质控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘稻花香二号’、‘盐丰’、‘辽星’大米（2018年收获）由中央储备粮沈阳直属库有限公司提供。

Bradford试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；十二烷基硫酸钠 国药集团化学试剂有限公司；所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FJ200高速分散均质机 上海沪析实业有限公司；SH-1000酶标仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；FE20K pH计 瑞士Mettler Toledo公司；ALC-110.4精密电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；BNCH 78磁力搅拌器 温州标诺有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品储藏

将稻谷用小型砻谷机去壳得到糙米，再在碾米机上制成GB/T 1354—2009《大米》所规定的标准一等大米。将上述大米储藏在相对湿度50%，温度分别为4、30 ℃和70 ℃的生化培养箱中300 d，每隔100 d取样。将大米研磨后过35 目筛，然后密封在高密度聚乙烯袋内，储存在－20 ℃条件下以供后续实验使用。

1.3.2 大米蛋白的制备

1.3.2.1 脱脂

大米粉用正己烷（m（大米）∶V（正己烷）＝1∶5）脱脂，25 ℃水浴振荡4 h后，静置1 h，除去上清液，在45 ℃下烘干12 h，风干后的脱脂米粉过60 目筛，备用。

1.3.2.2 碱溶酸沉处理

将大米粉与0.1 mol/L NaOH溶液以质量体积比1∶9混合。在25 ℃下搅拌4 h后，将溶液在4 ℃下以6 000×g离心30 min，并保留上清液。然后用2 mol/L HCl溶液将上清液的pH值调节至5.5后，沉淀出大米蛋白。用蒸馏水洗涤沉淀两次，在6 000×g、4 ℃下将悬浮液离心15 min。用2 mol/L NaOH溶液将蛋白质溶液的pH值调节至7.0，随后装入透析袋，并置于蒸馏水中低温透析24 h。透析过程中需要换4～5 次蒸馏水。最后冷冻干燥并保存在－20 ℃下。

1.3.3 溶解度的测定

蛋白的溶解度测定参考崔沙沙等的方法[18]。将500 mg大米蛋白溶解在5 mL 0.1 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，6 000×g离心10 min，制备蛋白悬浊液。上清液中的蛋白质量用Bradford试剂盒测定。利用牛血清白蛋白作标准曲线，用酶标仪在595 nm波长处测定吸光度。蛋白溶解度以每毫升磷酸盐缓冲液溶解的蛋白质量表示，按式（1）计算。

式中：m为溶解的蛋白质量/mg；V为磷酸盐缓冲液体积/mL。

1.3.4 持水性的测定

蛋白样品的持水性参考Kamara等的方法[19]测定。称取0.1 g待测蛋白样品，将样品分散于10 mL蒸馏水中，室温下磁力搅拌1 h，移入已称质量的离心管中，10 000 r/min，室温下离心15 min，倒掉上清液，称量此时离心管的质量。蛋白持水性按式（2）计算。

式中：m0为蛋白质量/g；m1为离心管质量/g；m2为离心后离心管和剩余物质量/g。

1.3.5 持油性的测定

蛋白样品的持油性参考Kamara等的方法[19]测定。称取1 g待测蛋白样品，并与10 mL精制大豆油充分混合，室温下磁力搅拌1 h，移入已称质量的离心管中。在10 000 r/min下离心15 min，拭去上面的油层，称量此时离心管质量。以每克蛋白质吸取大豆油的质量表示蛋白质的持油性，按式（3）计算。

式中：m0为蛋白质量/g；m1为离心管质量/g；m2为离心后离心管和剩余物质量/g。

1.3.6 起泡性质的测定

参考Singh等的方法[20]对蛋白样品起泡性质进行测定，包括起泡性和泡沫稳定性。称取25 mg蛋白样品，溶于25 mL 0.2 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液中，室温下以10 000 r/min均质2 min，记录均质停止时泡沫和液体的体积，静置30 min后再次记录泡沫和液体的体积。蛋白起泡性和泡沫稳定性分别按式（4）和式（5）计算。

式中：V0为溶解样品水溶液的体积/mL；V1为均质停止时泡沫和液体的总体积/mL；V2为30 min后泡沫和液体的总体积/mL。

1.3.7 乳化性质的测定

参考Li Yue等的方法[21]测定蛋白质的乳化特性，包括乳化性和乳化稳定性。将待测蛋白样品配制成质量浓度20 mg/mL的蛋白溶液。取25 mL蛋白溶液加到100 mL烧杯中，边搅拌边加入8 mL大豆油，在10 000 r/min下均质2 min，从烧杯底部取乳浊液50 μL，用质量分数0.1%十二烷基硫酸钠溶液稀释至10 mL，在500 nm波长处测定其吸光度（A0），按式（6）计算乳化活性。测定乳化活性后的乳浊液在室温下放置30 min，从烧杯底部取乳浊液50 μL，同上述方法稀释，在500 nm波长处测定其吸光度（At），按式（7）计算蛋白乳化稳定性。

式中：t为30 min。

1.4 数据处理与分析

所有实验均平行测定3 次，结果以平均值±标准差表示。实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，组间平均值比较采用Duncan法进行分析（以P＜0.05表示差异显著）。采用OriginPro 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 大米储藏期间蛋白质溶解度变化

蛋白质的溶解度是蛋白质与蛋白质-溶剂相互作用之间平衡的热力学表现，是食品蛋白质功能特性的重要先决条件。诸如温度、pH值、盐浓度和溶剂的介电常数等因素均会改变蛋白质溶解度，并且这些因素的变化会导致蛋白质结构构象的变化，进而影响蛋白质的功能特性[22]。在不同储藏温度下的3 种大米蛋白溶解度变化如图1所示。大米蛋白溶解度较低，主要因为大米蛋白含75%～90%碱溶性谷蛋白，这些谷蛋白由许多大分子片段通过二硫键形成，彼此交联凝聚，而溶于水的清蛋白仅占大米蛋白2%～5%[23]。由图1可知，在4 ℃储藏期间，‘稻花香二号’和‘辽星’的蛋白溶解度总体呈下降趋势，这可能因为储藏过程中发生蛋白质氧化，即巯基被氧化成二硫键，带有极性的巯基含量减少，高分子质量蛋白质含量增加，降低了蛋白质与水分子的作用，导致大米蛋白水合能力下降[24-25]。部分研究也发现米糠随着储藏时间的延长，二硫键含量增加，导致大分子质量米糠球蛋白聚集体形成，使溶解度逐渐降低[26]。相似地，本课题组前期研究同样发现储藏导致大米蛋白的二硫键含量增加[27]。但4 ℃储藏期间‘盐丰’的蛋白溶解度在储藏结束时却显著上升，这可能是因为长时间的储藏导致蛋白质被氧化修饰，引起蛋白质的解聚使其增溶[28]。在30 ℃储藏期间，3 种大米的蛋白溶解度总体呈下降趋势。随着温度的升高，70 ℃下储藏3 种大米的蛋白溶解度总体呈显著下降趋势，这可能是蛋白在高温储藏后发生热变性或者不溶性聚集体形成[11]。王章存等对热变性大米蛋白进行研究发现，大米蛋白经高温作用后溶解性较低，甚至凝固成为不溶性成分[29]。也有研究发现在室温下存放1～2 年的两种印度香米随着储藏时间的延长，蛋白质溶解性逐渐降低，导致两者的米汤固形物损失减少[30]。

图1 大米储藏期间蛋白质溶解度的变化Fig. 1 Changes in protein solubility during rice storage

2.2 大米储藏期间蛋白质持水性变化

优越的持水性能够使食品系统中引入更多的水，从而改善食品特性，保持样品的新鲜度、整体产品口感和质地。由图2可知，初始状态3 种大米蛋白持水性表现为‘稻花香二号’＞‘辽星’＞‘盐丰’，‘稻花香二号’初始状态拥有更高的持水性可能归因于其含有更多的亲水基团[31]。蛋白良好的吸水能力有助于减少包装烘焙食品水分的丧失[32]。3 种大米蛋白持水性在不同储藏温度下总体呈下降趋势，且70 ℃储藏期间下降幅度最大。‘稻花香二号’在4、30、70 ℃储藏末期，蛋白持水性较初始阶段分别下降了10.20%、13.19%和30.30%。持水性的下降可能是因为蛋白质中的游离巯基氧化形成二硫键，蛋白质聚集度加强，因而能截留的水分含量减少，导致蛋白质水合能力减弱[14]。本课题组前期研究发现储藏导致大米蛋白的表面疏水作用增强，这也可能使蛋白持水性下降[27]。此外，长时间的高温储藏导致部分蛋白质发生热变性，这也是蛋白持水性下降的重要原因[11]。

图2 大米储藏期间蛋白质持水性的变化Fig. 2 Changes in water-holding capacity of protein during rice storage

2.3 大米储藏期间蛋白质持油性变化

持油能力在增强产品口感和风味滞留上起关键作用[33]。储藏期间不同品种大米蛋白持油性变化见图3。与储藏前大米蛋白相比，3 种大米蛋白持油性在不同储藏温度下总体都呈现上升趋势，其中‘稻花香二号’在4、30、70 ℃储藏末期，蛋白持油性较初始分别上升了15.71%、18.69%和32.41%。持油性的提高可能是由于蛋白质的空间结构打开，暴露了部分疏水基团，进而截留更多的油[34]。此外，储藏会导致大米蛋白的表面疏水性持续增加，而持油性的增加与表面疏水性的增加有关[14,35]。王文高等的研究也发现随着表面疏水氨基酸含量的增加，蛋白吸油能力提升[36]。Lü Shiwen等报道在高温湿热（100 ℃、相对湿度70%）处理条件下，米糠蛋白的持油能力明显提高[11]。此外，其他研究也观察到在热处理材料中提取的蛋白质持油性得到明显改善，例如干热处理的大豆蛋白粉[37]和烘烤处理的脱脂榛子面粉[38]。这种高持油性意味着其可能对保持食品风味、改善适口性和延长保质期有促进作用。

图3 大米储藏期间蛋白质持油性的变化Fig. 3 Changes in oil-holding capacity of protein during rice storage

2.4 大米储藏期间蛋白质起泡性质变化

起泡性是面包、冰淇淋、蛋糕等食品加工过程中重要的品质控制指标。泡沫是两相体系，其气室被连续的液体层隔开。起泡性质取决于蛋白质在空气-水界面处快速吸附的能力以及在界面处发生的快速构象变化和重排[39]。如图4所示，3 种大米蛋白起泡性在不同储藏温度下总体都呈现下降趋势。李彤等发现将大米在30 ℃加速陈化6 周后谷蛋白的起泡性及泡沫稳定性下降[14]。Khan等还发现热稳定处理可能会降低米糠蛋白的起泡性质[33]。大米蛋白的低起泡性可以归因于二硫键含量高而导致的柔韧性降低[40]。此外，热诱导的热变性以及不溶性聚集体的形成使得蛋白质难以在空气-水界面扩散和吸附，最终也会导致起泡性下降[41]。起泡性质被破坏使得蛋白质样品在食品工业中的应用受到限制。

图4 大米储藏期间蛋白质起泡性的变化Fig. 4 Changes in foaming capacity of protein during rice storage

泡沫稳定性指蛋白质稳定泡沫抵抗重力和机械应力的能力。泡沫稳定性取决于在气泡周围形成的具有黏着性薄膜的稳定性[42]。溶液黏度高，泡沫稳定性相对较高。如图5所示，‘稻花香二号’和‘辽星’蛋白泡沫稳定性在不同储藏温度下总体都呈现上升趋势，这可能是储藏过程中蛋白质溶解度降低、不溶性蛋白含量增加、表面黏度提高所致[14]。然而‘盐丰’蛋白的泡沫稳定性在不同储藏温度下却总体呈现下降趋势。泡沫稳定性下降可能是储藏引起大米蛋白巯基转化形成二硫键，共价交联产生聚集体所致[43]。

图5 大米储藏期间蛋白质泡沫稳定性的变化Fig. 5 Changes in foam stability of protein during rice storage

2.5 大米储藏期间蛋白质乳化性质变化

乳化性质对于食品应用（例如各种传统和新型食品的开发）是非常重要的。蛋白质的乳化性质包括乳化性和乳化稳定性，其受油-水界面张力的影响，即蛋白质可以通过形成吸附层来控制油滴的扩散和聚集。蛋白质的乳化性能够反映蛋白质吸附在界面上的能力[10]，它是蛋白质作为表面活性剂在食品加工中的重要功能特性。蛋白质的乳化性受其摩尔质量、疏水性、构象稳定性、表面电荷以及诸如pH值、离子强度和温度等物理化学因素的影响[44]。如图6所示，在4 ℃储藏期间，‘稻花香二号’和‘辽星’的蛋白乳化性总体显著下降，这可能是由于溶解度的下降从而降低了大米蛋白在油-水界面吸附的能力[9]。而4 ℃储藏期间‘盐丰’的蛋白乳化性显著上升，这可能是因为4 ℃储藏期间蛋白溶解度的上升增强了大米蛋白在油-水界面吸附的能力。在30 ℃储藏期间，3 种大米的蛋白乳化性显著上升。此外，70 ℃下‘稻花香二号’的蛋白乳化性也呈现上升趋势。Kumagai等认为在酸性条件下，大米蛋白可能分解成更小的亚单位[45]。储藏期间由于小分子的蛋白促进了扩散，并且增强了蛋白质与脂质之间的相互作用[36]，这些因素可能导致蛋白乳化性的提升。其他研究也观察到椰子蛋白和榛子蛋白等植物蛋白在适当热处理后蛋白质中乳化特性发生改善[46]。但是70 ℃下‘辽星’和‘盐丰’的蛋白乳化性在储藏结束时却显著下降，这可能是因为蛋白质的聚集使得溶解度下降更剧烈，进而导致蛋白乳化性下降。

图6 大米储藏期间蛋白质乳化性的变化Fig. 6 Changes in emulsifying activity of protein during rice storage

乳化稳定性表示蛋白质形成强韧乳状液的能力。蛋白的乳化稳定性通常依靠非共价相互作用，例如氢键和静电作用、共价作用和吸附蛋白质分子间的巯基二硫化物交换反应等，当蛋白达到较好的亲水亲油性平衡时，乳化性质增强[47-49]。如图7所示，在4 ℃储藏期间，3 种大米的蛋白乳化稳定性总体呈现下降趋势，先前的研究也发现陈化导致米谷蛋白乳化稳定性下降[14]。在30 ℃储藏期间，3 种大米的蛋白乳化稳定性总体显著上升。这可能主要因为更多疏水性基团的暴露对乳化液起到了稳定作用[50]。但在70 ℃储藏期间，‘辽星’大米蛋白的乳化稳定性总体呈显著下降趋势。这可能是因为高温储藏期间蛋白质氧化程度增加，导致产生不可溶性聚集体，造成乳化稳定性降低[51]。

图7 大米储藏期间蛋白质乳化稳定性的变化Fig. 7 Changes in emulsion stability of protein during rice storage

3 结 论

在不同温度储藏期间，3 种大米的功能特性均发生明显改变。具体地说，储藏总体导致各种大米蛋白溶解度下降，但低温储藏能够促进‘盐丰’大米蛋白溶解。低温储藏使‘稻花香二号’和‘辽星’的蛋白乳化性下降，高温储藏则促进‘稻花香二号’蛋白乳化性上升，但‘盐丰’蛋白乳化性均表现总体上升趋势。低温会导致大米蛋白乳化稳定性下降。此外，3 种大米蛋白持水性和起泡性在不同储藏温度下都总体呈下降趋势，而持油性总体呈上升趋势。‘稻花香二号’和‘辽星’的泡沫稳定性在储藏期间总体呈上升趋势，然而‘盐丰’总体呈下降趋势。综上，储藏过程中大米蛋白质的功能特性会随着品种和储藏条件的不同有所差异，故未来需要开展更充分的研究。