魏亚楠，Esrat Mahmud SILVY，彭 慧，杨 乾，王 霆，贠建民，毕 阳

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

双孢菇是全球种植范围最广、产量最大的食用菌[1]。但双孢菇在采后贮藏、运输和销售期间极易软化，对销售品质影响很大[2]。针对双孢菇采后软化的问题，前人开发了多种控制措施，除控制采后温度和气调包装外，一些化学药物也表现出一定的控制效果[3]。但由于采后双孢菇对浸泡处理非常敏感，遇水后会加速褐变。因此，亟需开发有效控制双孢菇软化的非采后浸泡方法。有报道表明，1-甲基环丙烯熏蒸可抑制双孢菇中蛋白质的分解，维持蛋白质含量，有效延缓软化[4]。薄荷精油熏蒸能减少双孢菇采后质量损失，维持可溶性蛋白质和总糖含量，保持较高的白度、硬度和感官特性[5]。O3熏蒸可抑制双孢菇代谢，推迟呼吸高峰的出现，延缓采后软化[6]。苯丙噻重氮（benzothiadiazole，BTH）是水杨酸（salicylic acid，SA）的类似物，也是第一个人工合成并商业化的诱抗剂，可诱导多种果蔬的采后抗病性[7]。除了诱导抗性的作用外，BTH处理可维持厚皮甜瓜果实的采后硬度，提高果实采后品质[8]。采前BTH喷洒可有效维持采后桃果实硬度[9]。采前使用SA和乙酰水杨酸喷洒可有效保持甜樱桃的采后硬度[10]。BTH结合不同包装材料能有效降低金针菇呼吸强度、抑制丙二醛的产生、减少质量损失，提高贮藏品质[11]。另有研究结果表明，采前茉莉酸甲酯喷洒可有效减轻采后双孢菇的质量损失，保持质地，提高外观品质，延长货架期[12]。因此推测采前BTH处理对维持双孢菇采后品质具有积极的作用。尽管已有采后BTH处理维持金针菇贮藏品质以及采前茉莉酸甲酯喷洒控制双孢菇采后软化的报道，但采前BTH喷洒对采后双孢菇质地的影响尚鲜见报道。本研究采用BTH在双孢菇生长的原基期（双孢菇菌盖为针头大小时）进行喷洒，分析采收时及低温贮藏期间的质地，测定细胞壁组分含量及相关酶活力，以期为维持双孢菇采后质地提供方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试‘A15’双孢菇（Agaricus bisporuscv. A15）种植于甘肃省金沃森生物有限公司，田间管理措施参照工厂化生产的双孢菇种植规程。

BTH（纯度≥98%） 美国Sigma-Aldrich公司；微生物纤维素试剂盒、微生物几丁质试剂盒、微生物总蛋白试剂盒、微生物纤维素酶试剂盒、微生物几丁质酶试剂盒、微生物中性蛋白酶试剂盒、微生物碱性蛋白酶试剂盒、微生物酸性蛋白酶试剂盒 上海通蔚实业有限公司。

1.2 仪器与设备

美工刀 日本OLFA SAC-1公司；A 11 basic S025研磨机 艾卡（广州）仪器设备有限公司；TA.XT plus型质构仪 英国Stable Micro Systems公司；DW-HL388型超低温冷冻储存箱 中国中科美菱低温科技有限责任公司；1510型酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 双孢菇采前BTH处理及采后贮藏

参照Zhang Zhengke等[13]的方法。将BTH直接溶于自来水中，制备成200 mg/L溶液（含体积分数0.05%Tween-80）。在一潮菇的原基期进行喷洒，每2 L药液处理1 块菇床（1.3 m×1.6 m）。每组处理喷洒1 个菇床，重复3 次，以自来水（含体积分数0.05% Tween-80）作为对照。

喷洒后7 d开始采收。采摘后随即放入预冷库－10 ℃预冷0.5 h后，转移至4 ℃冷库。拣选大小均匀（菌盖直径3 cm左右）、色泽一致、朵型完整、菇盖圆润、无病害无损伤的双孢蘑菇子实体装至保鲜盒（15 cm×10 cm×8 cm），每盒装蘑菇7 个，将每个保鲜盒用聚乙烯保鲜膜（厚20 μm）完全密封后运回实验室，于4 ℃下贮藏，分别于贮藏的0、2、4、8、12、16、20 d取样进行相关指标测定。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 质量损失率的测定

质量损失率的测定采用称质量法[14]。在贮藏过程中将双孢菇从冷库中取出称质量，按下式计算质量损失率。每处理用双孢菇8 盒，重复3 次。

1.3.2.2 菌盖质构特性的测定

参照Kotwaliwale等[15]的方法，将双孢菇菌盖（1 cm×1 cm×1 cm）置于质构仪台面，选用P/36R探头进行质地多面剖析（texture profile analysis，TPA）实验。参数设置：预压速率、下压速率、压后上行速率均为5 mm/s，两次压缩中间停顿10 s，试样压缩比为40%，触发力为5 N。测定参数包括硬度、弹性、咀嚼性和胶着性。每处理用双孢菇7 个，重复3 次。

1.3.2.3 菌盖生化指标的测定

将双孢菇从冷库中取出，用美工刀取垂直于菌盖表皮1 cm深的组织，液氮冷冻后用研磨机研成粉末装在离心管中，在－80 ℃超低温冷冻储存箱中保存，用于测定生化指标。

纤维素、几丁质、总蛋白含量和纤维素酶、几丁质酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶活力均采用按照相应酶联免疫试剂盒说明书进行测定。结果均以组织鲜质量计。

1.4 数据统计与分析

各指标测定至少重复3 次。所有数据采用Excel 2007软件计算平均值和标准偏差，采用SPSS 19.0软件进行Duncan’s差异显著性分析和Pearson相关性分析，P＜0.05表示差异显著，使用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 采前BTH喷洒对冷藏期间双孢菇质量损失率的影响

质量损失是影响双孢菇质地的重要因素。由图1可知，贮藏期间，BTH处理组和对照组双孢菇质量损失率均逐渐升高，BTH处理组双孢菇的质量损失率在贮藏中期（4～12 d）显著低于对照组，第8天时比对照组低34.22%（P＜0.05）。质量损失率的分析结果表明，采前BTH喷洒显著降低了冷藏期间双孢菇的质量损失。

图1 采前BTH喷洒对冷藏期间双孢菇质量损失率的影响Fig. 1 Effect of pre-harvest BTH spraying on mass loss rate of A. bisporus during cool storage

2.2 采前BTH喷洒对冷藏期间双孢菇菌盖质地的影响

硬度、弹性、咀嚼性和胶着性是反映质地的重要指标，刚采收时双孢菇菌盖紧实，随着贮藏时间的延长，菌盖逐渐自溶软化。由图2可知，与对照组相比，采前BTH喷洒显著提高了采收时（0 d）的双孢菇菌盖硬度、弹性、咀嚼性和胶着性（P＜0.05）。贮藏的前8 d，BTH处理组和对照组的菌盖硬度、咀嚼性和胶着性迅速降低，但BTH处理组菌盖硬度、咀嚼性和胶着性均显著高于对照组（P＜0.05）。贮藏8 d后BTH处理组和对照组的菌盖硬度、咀嚼性和胶着性下降速度趋于平缓，且两组之间无显著差异。贮藏期间，BTH处理组和对照组的菌盖弹性缓慢降低，在前8 d，BTH处理组菌盖弹性显著高于对照组（P＜0.05），8 d后BTH处理组与对照组间无显著差异。上述结果表明，采前BTH处理有效延缓了采收时以及冷藏期间双孢菇菌盖的硬度、弹性、咀嚼性和胶着性的下降。

图2 采前BTH喷洒对冷藏期间双孢菇菌盖硬度（A）、弹性（B）、咀嚼性（C）和胶着性（D）的影响Fig. 2 Effect of pre-harvest BTH spraying on firmness (A), flexibility (B),chewiness (C) and gumminess (D) of A. bisporus caps during cool storage

2.3 采前BTH喷洒对冷藏期间双孢菇菌盖几丁质酶、纤维素酶活力以及几丁质、纤维素含量的影响

纤维素和几丁质是双孢菇细胞壁的主要成分，纤维素酶和几丁质酶分别是这两种成分的降解酶。采收时，BTH处理组菌盖的几丁质酶活力显著低于对照组（P＜0.05）；贮藏期间，BTH处理组和对照组菌盖的几丁质酶活力均逐渐上升，BTH处理组菌盖的几丁质酶活力在贮藏中后期显著低于对照组，第16天时比对照组低23.37%（P＜0.05）（图3A）。采收时，BTH处理组菌盖的几丁质含量略高于对照组，但无显著差异；贮藏期间，BTH处理组和对照组的几丁质含量逐渐降低，BTH处理组菌盖的几丁质含量除第4天外均显著高于对照组（P＜0.05）（图3B）。采收时，BTH处理组菌盖的纤维素酶活力显著低于对照组（P＜0.05）；贮藏期间，BTH处理组和对照组菌盖的纤维素酶活力均逐渐上升，BTH处理组菌盖的纤维素酶活力除第20天外均显著低于对照组（P＜0.05）（图3C）。采收时，BTH处理组菌盖的纤维素含量显著高于对照组（P＜0.05）；贮藏期间，BTH处理组和对照组菌盖的纤维素含量逐渐下降，除4 d和8 d外，BTH处理组菌盖的纤维素含量均显著高于对照组（P＜0.05）（图3D）。上述结果表明，采前BTH喷洒有效抑制了采收时和冷藏期间双孢菇的几丁质酶和纤维素酶活力，延缓了几丁质和纤维素的降解。

图3 BTH采前喷洒对冷藏期间双孢菇菌盖几丁质酶活力（A）、几丁质含量（B）、纤维素酶活力（C）和纤维素含量（D）的影响Fig. 3 Effect of pre-harvest BTH spraying on chitinase activity (A),chitin content (B), cellulase activity (C) and cellulose content (D)in A. bisporus caps during cool storage

2.4 采前BTH喷洒对冷藏期间双孢菇中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶活力以及总蛋白含量的影响

蛋白质是双孢菇细胞壁的主要成分，蛋白酶则参与蛋白质的降解。采收时，BTH处理组菌盖的中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力显著低于对照组（P＜0.05），碱性蛋白酶活力与对照组无显著差异。贮藏期间，BTH处理组和对照组菌盖的中性蛋白酶活力基本稳定，BTH处理组在贮藏后期中性蛋白酶活力显著低于对照组（P＜0.05）（图4A）。贮藏期间，BTH处理组和对照组菌盖的碱性蛋白酶活力呈双峰型变化，BTH处理组总体显著低于对照组，第8天时，比对照组低20.58%（P＜0.05）（图4B）。BTH处理组和对照组菌盖的酸性蛋白酶活力随贮藏时间的延长呈先升高后降低的趋势，BTH处理组显著低于对照组，第16天时比对照组低38.94%（P＜0.05）（图4C）。采收时，BTH处理组菌盖的总蛋白含量显著高于对照组，贮藏期间，BTH处理组和对照组菌盖的总蛋白含量逐渐减少，BTH处理组均显著高于对照组（P＜0.05）（图4D）。上述结果表明，与对照组相比，采前BTH喷洒有效降低了采收时和冷藏期间双孢菇中性、碱性和酸性蛋白酶活力，延缓了蛋白质的降解。

图4 BTH采前喷洒对冷藏期间双孢菇菌盖的中性蛋白酶（A）、碱性蛋白酶（B）和酸性蛋白酶（C）活力以及总蛋白含量（D）的影响Fig. 4 Effect of pre-harvest BTH spraying on the activity of neutral protease (A), alkaline protease (B) and acid proteinase (C), and total protein content (D) in A. bisporus caps during cool storage

2.5 双孢菇菌盖质构指标与几丁质、纤维素和总蛋白含量以及质量损失率之间的相关性分析结果

为了验证与双孢菇软化相关的8 个指标（菌盖硬度、弹性、咀嚼性、胶着性4 个质构指标与几丁质含量、纤维素含量、总蛋白含量、质量损失率）之间的关系，对其进行了Pearson相关性分析。由表1可知，这8 个指标间均呈极显著相关（P＜0.01）。其中硬度、弹性、咀嚼性、胶着性与几丁质含量呈极显著正相关，相关系数r分别为0.840、0.957、0.849、0.876，与纤维素含量呈极显著正相关，r分别为0.784、0.888、0.772、0.812，与总蛋白含量呈极显著正相关，r分别为0.644、0.783、0.633、0.678，与质量损失率呈极显著负相关，r分别为－0.855、－0.939、－0.853、－0.881。上述分析表明，双孢菇采后质地软化是细胞壁各组分共同降解的结果，质量损失会加速软化。

表1 双孢菇菌盖质构指标与几丁质、纤维素和总蛋白含量以及质量损失率之间的相关性Table 1 Correlations between texture properties of A. bisporus caps and the contents of chitin, cellulose and protein, as well as mass loss rate

3 讨 论

软化是双孢菇采后的典型质地变化现象，表现为菌盖组织松散、硬度明显降低[4]。双孢菇的细胞壁主要由几丁质、纤维素和蛋白质组成，大多数几丁质靠近细胞质膜，β-葡聚糖穿插于整个细胞壁[16]，蛋白质紧紧地交织在几丁质和葡聚糖基结构基质中[17]。分布在细胞壁中的蛋白质通常与多糖交联形成糖蛋白[18]。双孢菇采后体内几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶活化，相应的细胞壁组分水解，最终导致软化[19]。

几丁质是由多个N-乙酰基葡萄糖单元组成的长链聚合物[20]，为真菌细胞壁提供支撑与保护[21]。几丁质在几丁质酶和β-N-乙酰己糖胺酶协同作用下降解[22]。本研究发现，与对照相比，采前BTH喷洒降低了双孢菇采收时和冷藏期间的几丁质酶活性，增加了几丁质含量。有报道表明，乙烯可诱导菠萝几丁质酶的合成[23]和柿子果实细胞壁的降解，加速果实软化[24]。由于BTH处理可以抑制厚皮甜瓜的乙烯释放[8]。因此，BTH可能通过抑制乙烯的生成来减少几丁质酶对双孢菇细胞壁几丁质的降解。纤维素是葡萄糖通过1,4-糖苷键连接而成的直链高分子化合物[25]，纤维素在纤维素酶的作用下进行水解[26]。本研究发现，与对照相比，采前BTH喷洒显著降低了采收时和冷藏期间双孢菇的纤维素酶活性，减缓了纤维素的分解。该结果与SA处理显著抑制香梨果实纤维素酶活性、减缓纤维素含量的下降的结果[27]类似。由于纤维素酶的活性也受乙烯的调控[28]，因此，BTH可能通过抑制乙烯的合成来减少纤维素酶对双孢菇细胞壁纤维素的降解。蛋白酶是水解蛋白质肽链酶的总称，按其反应的最适pH值分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶3 类，酸性蛋白酶的活性中心通常含有2 个天冬氨酸残基，属于天冬氨酸蛋白酶，最适pH值为2.5～5.0，最适反应温度为30～50 ℃[29]。中性蛋白酶的活性中心往往含有Zn2＋，属于金属蛋白酶，活性依赖于其含有的二价金属阳离子[30]。已发现的微生物碱性蛋白酶活性中心大多含有丝氨酸，属于丝氨酸蛋白酶，大多数碱性蛋白酶的最适pH值在9.0～11.0之间[31]。本研究发现，与对照相比，采前BTH喷洒显著降低了采收时和冷藏期间双孢菇酸性、中性和碱性蛋白酶的活性，增加了蛋白质的含量。该结果与BTH处理增加甜瓜叶片可溶性蛋白含量的结果[32]类似。由于蛋白酶的活性也受乙烯的调控[33]，因此，BTH可能通过抑制乙烯的合成来减少蛋白酶对双孢菇细胞壁蛋白质的降解。至于BTH如何通过调控乙烯产生来抑制双孢菇几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的活性尚有待进一步研究。

质量损失影响双孢菇的软化，质量损失率越大，软化越严重[34]。本研究发现，与对照相比，采前BTH喷洒显著降低了冷藏期间双孢菇的质量损失率，该结果与BTH处理抑制厚皮甜瓜质量损失率的结果[8]类似。蒸腾失水和呼吸消耗是导致双孢菇采后质量损失的主要原因[29,35]。有报道表明，采前BTH处理会增加甜瓜果实表面保护组织的厚度，从而减少水分蒸腾[36]。BTH处理会抑制金针菇的呼吸强度，从而减少底物的消耗[11]。因此，推测采前BTH喷洒可能通过增加双孢菇表面保护组织的厚度以及抑制双孢菇的呼吸强度来降低冷藏期间的质量损失率。至于BTH处理如何影响双孢菇表面保护组织以及菇体呼吸强度尚有待进一步揭示。

本实验中，与对照相比，采前BTH喷洒能显著降低采后双孢菇冷藏期间的质量损失率，提高采收时以及冷藏期间双孢菇的硬度、弹性、咀嚼性和胶着性，降低冷藏期间双孢菇的几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶活性，延缓细胞壁组分几丁质、纤维素和蛋白质的降解，维持冷藏期间双孢菇的质地。鉴于BTH的安全性以及原基期喷洒简便的特点，该方法可作为一种有效维持双孢菇采后质地的措施。