王 懿，侯媛媛，马钰晴，朱 璇，郑永华，金 鹏,*

（1.南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

桃（Prunus persica(L.) Batsch）属于呼吸跃变型果实，一般在高温多雨的夏季成熟，桃果实皮薄质软，采后极易受到机械损伤，在常温下易软化腐败，不耐贮藏[1]。低温能有效抑制桃果实后熟软化，延长桃果实采后贮藏寿命[2]。但桃果实属于冷敏性果实，长期低温贮藏会导致桃果实发生冷害，其主要症状包括果肉褐变、木质化或絮败、不能正常后熟、固有风味变淡甚至丧失等[3]，降低了桃果实的商品价值。因此，研究桃果实冷害发生机理并提高冷藏桃果实的贮藏品质是目前解决桃果实采后贮藏保鲜的关键课题。

低温胁迫会诱导植物体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量积累，导致膜脂过氧化、蛋白质和核苷酸等一系列氧化损伤，从而诱导细胞死亡[4-5]。植物体内存在由酶促防御系统和非酶促抗氧化剂防御系统共同组成的活性氧清除系统[5]。抗坏血酸-谷胱甘肽（ascorbic acid-glutathione，AsA-GSH）循环是非酶促抗氧化系统的重要组成部分。AsA-GSH循环一方面可以通过抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）的催化作用直接清除植物体内产生的过氧化氢（H2O2）；另一方面，AsA-GSH循环能够促进两种非酶类抗氧化剂（AsA和GSH）的生成，从而维持植物体内氧化还原物质的平衡[6-7]。果实抗冷性的增强与调节AsA-GSH循环系统有关这一结论已经在枇杷[8]、甜椒[9]、番茄[10]、桃[11]果实中得到证实。因此，促进AsA-GSH循环对减轻低温诱导的果实氧化损伤具有重要的作用。

甘氨酸甜菜碱（glycine betaine，GB）是一种季胺化合物，是保持植物正常生理功能的重要渗透保护剂，其可以作为两性离子与蛋白质复合物和膜的亲水性和疏水性域相互作用，从而有助于稳定蛋白质，以保护胁迫植物的亚细胞结构[12]。近年来，GB处理在果蔬采后中的应用越来越受到关注。已有大量研究表明，GB处理在缓解梨[13]、枇杷[14]、香蕉[15]和西葫芦[16]等果实冷害中发挥着重要作用。本课题组先前的研究发现，在采后桃果实中，GB处理可以通过调控能量代谢[17]、糖代谢和酚类代谢[18]，增强桃果实的抗冷性。但外源GB处理通过调控AsA-GSH循环系统清除过量的ROS来减轻桃果实冷害的研究还鲜有报道。本实验以桃果实为实验材料，研究10 mmol/L GB处理对桃果实AsA-GSH循环中相关代谢产物的含量、关键酶活性及相关基因表达的调控作用，以及对桃果实H2O2含量和膜脂过氧化程度的影响，以期从AsA-GSH循环系统清除ROS的角度探讨GB处理提高采后桃果实抗冷性的作用机理，为GB处理在桃果实采后冷藏中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验选取的‘湖景蜜露’桃果实于2019年7月采收于江苏省农科院，选择大小均匀、成熟度一致，无任何机械损伤和病虫害的桃果实作为实验样品（单果质量约为170～210 g）。

GB、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、AsA、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、氯化铁（FeCl3） 北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）国药集团化学试剂有限公司；A061-1谷胱甘肽试剂盒南京建成生物工程研究所；乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸吡哆醛、还原型辅酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、2,2-联吡啶溶液 上海瑞永生物科技有限公司；Hifair®III 1st strand cDNA Stnthesis SuperMix（gDNA digesster plus）（11141ES60）试剂盒、Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix（11202ES03/80/60）试剂盒 上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GL-20G-H型冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；MIR-253三洋恒温培养箱 上海恒逸实业有限公司；FA1204B型分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；UV-1600型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；DDS-11A型电导率仪 上海第二分析仪器厂；荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（配有QuantStudio™ 5实时荧光定量PCR系统） 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桃果实GB处理

桃果实在采摘后2 h内运回实验室，约30 min散去田间热后，将挑选出来的桃果实随机分成两组（GB组和对照组），每组200 个。将GB组的桃果实置于10 mmol/L GB溶液中浸泡10 min；对照组的桃果实置于无菌去离子水中浸泡10 min，取出自然晾干。每6 个桃果实装入0.01 mm厚的聚氯乙烯塑料袋中，袋口用普通橡皮筋绕两圈，在（0±1）℃、相对湿度90%的恒温箱中贮藏，每隔7 d进行取样并测定相关指标，贮藏35 d后结束。

1.3.2 冷害指数的测定

在贮藏21、28、35 d分别取18 个桃果实测定冷害指数[17,19]。取样后将桃果实置于20 ℃、相对湿度90%的恒温箱中贮藏3 d（模拟货架期条件）后，将果实沿着轴向直径切开，根据切面褐变面积所占果实切面总面积的百分比将冷害指数分为5 个等级：0 级，无冷害；1 级，褐变面积＜5%；2 级，5%＜褐变面积＜25%；3 级，25%＜褐变面积＜50%；4 级，褐变面积＞50%，参考文献[19]按以下公式计算冷害指数。

1.3.3 相对电导率的测定

桃果实的相对电导率参照文献[20]进行测定，每组选取6 个桃果实，结果取平均值。

1.3.4 丙二醛含量和H2O2含量的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量参照文献[19]进行测定，单位为nmol/g。H2O2含量参照文献[21]测定，单位为μmol/g，以上结果均以鲜质量计。

1.3.5 AsA含量和脱氢抗坏血酸含量的测定

AsA含量和脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）含量测定参照文献[22]的方法并略作修改。将2 g样品在5 mL 60 g/L的TCA溶液中充分研磨，在4 ℃、12 000 ×g下离心20 min，取出上清液用于后续测定。AsA反应体系含1 mL上清液、1.0 mL 100 g/L的TCA溶液、0.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、0.8 mL 20 g/L的2,2-联吡啶溶液、0.8 mL 42%（体积分数）磷酸溶液和0.4 mL 30 g/L的FeCl3溶液。总AsA反应体系是将1 mL上清液、0.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）与0.2 mL 6 mmol/L的DTT溶液混合，在42 ℃水浴保温15 min后，加入0.2 mL 4 g/L的N-乙基马来酰亚胺溶液，漩涡混匀后，再加入其他反应液。测定两个反应体系在525 nm波长处的吸光度。总AsA、AsA含量用AsA作为标准物质构建标准曲线计算，DHA含量是总AsA含量与AsA含量的差值。以上结果均以鲜质量计，单位为mg/kg。

1.3.6 GSH含量和GSSG含量的测定

以5 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）作为提取液，将2 g果肉研磨成匀浆，随后在4 ℃、12 000 ×g条件下离心20 min，取上清液。根据A061-1谷胱甘肽试剂盒说明书测定GSH、GSSG的含量，结果以鲜质量计，单位为nmol/g。

1.3.7 APX、GR、MDHAR、DHAR活力的测定

APX活性参照文献[23]进行测定。

GR活力测定参照文献[24]的实验方法，并略作调整。将2 g样品在5 mL 0.1 mol/L的磷酸钠缓冲液（pH 7.5）中充分研磨，在4 ℃、12 000 ×g下离心20 min，取出上清液待测定。反应体系含1.0 mL上清液、0.15 mL 5 mmol/L的GSSG溶液和1.85 mL 0.1 mol/L的磷酸钠缓冲液（pH 7.5），加入0.1 mL 4 mmol/L的NADPH溶液启动反应，记录340 nm波长处的吸光度变化。

MDHAR、DHAR活力的测定参照文献[22]的方法并略作调整。将2 g样品在5 mL 50 mmol/L磷酸钠缓冲液（含有0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、体积分数为0.3%的Triton-100和40 g/L的聚乙烯吡咯烷酮，pH 7.5）充分研磨，在4 ℃、12 000 ×g下离心20 min取上清液待测。MDHAR反应体系含0.4 mL上清液、1.5 mL 50 mmol/L的磷酸钠缓冲液（含有0.2 mmol/L NADPH、2.5 mmol/L AsA，pH 7.5），以0.1 mL 0.25 U/mL抗坏血酸氧化酶溶液启动反应，记录340 nm波长处吸光度变化。DHAR反应体系含0.1 mL上清液、2.8 mL 50 mmol/L的磷酸钠缓冲液（含有5 mmol/L GSH，pH 7.5），用0.1 mL 2 mmol/L的DHA溶液启动反应，记录265 nm波长处吸光度变化。

以上酶均以每克鲜质量样品每分钟吸光度变化0.01为1 个酶活力单位U。

1.3.8 AsA-GSH循环相关基因表达量的测定

采用十六烷基三甲基溴化铵方法提取冷冻组织中的总RNA。按照反转录试剂盒说明书将RNA反转为cDNA，参照Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix（Low Rox）试剂盒的说明，使用表1中的基因引物进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR反应体系为10 μL Green Master Mix（Low Rox）、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、1 μL模板DNA，加入无菌超纯水至20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变形10 s，60 ℃退火30 s，循环40 次，使用2－ΔΔCt方法计算结果。

表1 用于实时荧光定量PCR分析的基因特异性引物序列Table 1 Gene-specific primer sequences used for real-time fluorescence polymerase chain reaction

1.4 数据统计分析

采用Excel 2016和SPSS 25软件对数据进行统计分析，实验结果均表示为平均值±标准差，采用Duncan多重比较法检验数据的差异显著性，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 GB处理对桃果实冷藏期间冷害指数的影响

桃果实在（0±1）℃下贮藏21、28、35 d后的冷害指数如图1所示，随着贮藏时间的延长，对照组和GB组桃果实冷害指数不断增加，但GB组果实冷害指数显著始终低于对照组（P＜0.05）。在贮藏35 d后，对照组的桃果实冷害指数达到83.59%，而GB组的冷害指数仅为对照组的79.75%。说明GB处理可以抑制桃果实的冷害发生，减轻低温损伤。

图1 GB处理对桃果实冷藏期间冷害指数的影响Fig. 1 Effect of GB treatment on chilling injury index in peach fruit during cold storage

2.2 GB处理对桃果实冷藏期间相对电导率和MDA含量的影响

如图2A所示，在整个贮藏期间，桃果实的相对电导率总体呈逐渐上升的趋势，但GB组果实的相对电导率始终低于对照果实，在贮藏14～35 d时差异显著（P＜0.05）。如图2B所示，MDA含量的变化趋势与相对电导率相似，随着果实冷害程度的不断增加，MDA含量持续积累，而且在贮藏7～35 d内，GB处理的桃果实中MDA含量显著低于对照组（P＜0.05）。在贮藏35 d时，GB组果实MDA含量低于对照组果实14.13%。这表明GB处理可以显著抑制桃果实膜透性增加，减少MDA的积累，在一定程度上维持细胞膜的完整性，从而减轻低温对细胞膜造成的损害。

图2 GB处理对桃果实冷藏期间相对电导率（A）和MDA含量（B）的影响Fig. 2 Effect of GB treatment on relative electric conductivity (A) and MDA content (B) in peach fruit during cold storage

2.3 GB处理对桃果实冷藏期间H2O2含量的影响

如图3所示，桃果实H2O2含量随着冷藏时间的延长不断上升，而GB组果实的H2O2含量在整个贮藏期间显著低于对照组，在贮藏结束时GB组H2O2含量比对照组低17.24%。H2O2的含量越高说明植物体内遭受的氧化应激程度越高，这表明外源GB处理可以抑制冷藏期间桃果实H2O2的过量积累，减轻氧化应激对果实造成的损伤，维持活性氧代谢的平衡。

图3 GB处理对桃果实冷藏期间H2O2含量的影响Fig. 3 Effect of GB treatment on H2O2 content in peach fruit during cold storage

2.4 GB处理对桃果实冷藏期间AsA-GSH循环中代谢产物含量的影响

如图4A所示，桃果实冷藏期间AsA含量总体呈逐渐下降的趋势，但GB组果实的AsA含量始终高于对照组。在贮藏35 d时，GB组果实的AsA含量显著高于对照组0.64 mg/kg（P＜0.05）。桃果实DHA含量在贮藏期间无明显的变化趋势（图4B），但GB组果实的DHA含量低于对照组，在贮藏7、21 d和28 d时差异显著（P＜0.05）。桃果实中AsA/DHA在贮藏期间呈逐渐减小的趋势，与对照组果实相比，GB组桃果实始终维持较高的AsA/DHA（图4C）。如图4D所示，桃果实GSH含量随着冷藏时间的延长呈先上升后下降的趋势，整个贮藏期间，GB组果实GSH含量始终高于对照组，在贮藏14～35 d时差异显著（P＜0.05）。GB组果实在28 d后达到峰值，比同时期对照组高29.08%。桃果实中GSSG含量在冷藏期间逐渐下降（图4E），在贮藏前21 d时，GB组GSSG含量显著高于对照组（P＜0.05），而在28～35 d时，GB组中GSSG的含量则低于对照组。桃果实中GSH/GSSG比例在贮藏期间逐渐增加，GB组始终维持较高的GSH/GSSG水平（图4F）。这说明GB处理能积极调节桃果实冷藏期间AsA和GSH的氧化还原状态，使果实内维持较高的AsA、GSH含量和AsA/DHA、GSH/GSSG比例，增强果实在低温下的抗氧化能力。

图4 GB处理对桃果实冷藏期间AsA含量（A）、DHA含量（B）、AsA/DHA（C）、GSH含量（D）、GSSG含量（E）和GSH/GSSG（F）的影响Fig. 4 Effect of GB treatment on AsA content (A), DHA content (B),AsA/DHA ratio (C), GSH content (D), GSSG content (E) and GSH/GSSG ratio (F) in peach fruit during cold storage

2.5 GB处理对桃果实冷藏期间APX、GR、MDHAR和DHAR活力的影响

如图5A所示，桃果实冷藏过程中APX活力呈先上后降的趋势，在贮藏14 d时达到最大值，GB组果实APX活力始终显著高于对照组（P＜0.05）。桃果实冷藏期间GR活力呈先上升后下降的趋势（图5B），与对照果实相比，GB组果实始终保持较高的GR活力，在贮藏28 d时比对照组高48.05%（P＜0.05）。桃果实冷藏期间MDHAR活力先上升后下降（图5C），而GB处理能维持较高的MDHAR活力，在贮藏7、35 d时，GB组果实中MDHAR活力分别显著高于对照组14.65%和9.42%（P＜0.05）。如图5D所示，桃果实冷藏期间DHAR活力变化趋势与MDHAR类似，在贮藏第7d时达到最大值，随后逐渐下降，GB组果实DHAR活力始终高于对照组，在贮藏7～28 d时差异显著（P＜0.05）。这说明GB处理能显著提高桃果实冷藏期间AsA-GSH循环中关键酶的活力，促进活性氧的清除。

图5 GB处理对桃果实冷藏期间APX活力（A）、GR活力（B）、MDHAR活力（C）和DHAR活力（D）的影响Fig. 5 Effect of GB treatment on the activities of APX (A), GR (B),MDHAR (C) and DHAR (D) in peach fruit during cold storage

2.6 GB处理对桃果实冷藏期间PpAPX、PpGR、PpMDHAR和PpDHAR基因相对表达量的影响

如图6A所示，桃果实冷藏期间PpAPX基因相对表达量总体呈先上升后下降的趋势，GB组和对照组分别在7 d和14 d达到最大值，GB处理能维持较高的PpAPX相对表达量。桃果实PpGR基因相对表达量在贮藏前14 d呈下降的趋势，从贮藏21 d开始明显增加（图6B）。与对照组相比，GB处理可以显著上调桃果实PpGR相对表达量（P＜0.05）。如图6C所示，桃果实PpMDHAR基因相对表达量在贮藏7 d时急剧上升，随后逐渐下降，GB组果实PpMDHAR基因相对表达量在贮藏7 d和28～35 d时显著高于对照果实（P＜0.05）。由图6D可知，整个贮藏期间，对照组桃果实PpDHAR相对表达量呈逐渐下降的趋势，而GB组果实PpDHAR相对表达量整体呈先升后降的趋势。GB处理在贮藏7 d时PpDHAR相对表达量显著上调（P＜0.05），比对照果实高1.11 倍。这说明GB处理可以上调AsA-GSH循环中PpAPX、PpGR、PpMDHAR和PpDHAR关键基因的表达，提高AsA-GSH循环系统中关键酶的活性，从而增强果实的抗氧化能力。

图6 GB处理对桃果实冷藏期间PpAPX（A）、PpGR（B）、PpMDHAR（C）和PpDHAR（D）基因相对表达量的影响Fig. 6 Effect of GB treatment on the relative expression of PpAPX (A), PpGR (B), PpMDHAR (C) and PpDHAR (D) gene in peach fruit during cold storage

3 讨 论

在适宜条件下，植物细胞内ROS的积累和清除处于稳定的平衡状态，而非生物胁迫会破坏这种平衡，诱导氧化应激，引发过量的ROS积累[16]。相对电导率和MDA含量分别表示细胞膜透性和膜脂质过氧化程度，一般用于评估细胞膜的损伤程度[26]。研究表明，GB是含氮的相容性渗透物质之一，它可以通过维持蛋白质活性，保护细胞膜完整性和有效清除有毒ROS来激活非生物胁迫的防御反应[27-28]。已有研究报道外源GB处理可以降低H2O2水平，提高番茄植株的耐冷性[29]。孙玉洁等[30]研究发现10 mmol/L甜菜碱处理能减缓枇杷果实相对电导率的上升，同时有效抑制MDA和H2O2含量的积累，从而减轻了枇杷果实果心褐变。本研究发现，GB处理的桃果实中MDA含量、H2O2含量以及相对电导率的上升速度相对缓慢，其冷害指数也显著低于对照组（P＜0.05），这与GB处理番木瓜果实中得到的结果一致[21]。因此，外源GB处理通过抑制桃果实冷藏期间电导率和MDA含量的上升，减轻H2O2对细胞造成的氧化损伤，维持细胞膜的完整性，从而减轻果实的冷害。

AsA-GSH循环是植物体内重要的H2O2清除系统，AsA和GSH是此循环中重要的非酶促抗氧化剂，其氧化还原状态可以代表细胞环境中的氧化还原状态[6]。AsA/DHA和GSH/GSSG可以反映植物的氧化还原能力，一般还原性物质含量越高，对植物的抗胁迫能力越强[6,31]。在本研究中，GB处理始终维持桃果实中较高的AsA、GSH含量和AsA/DHA、GSH/GSSG比例，这与水杨酸处理增强脐橙果实抗氧化能力的结果一致[32]。Li Huizi等[10]发现冷驯化可以增强番茄果实的抗冷性，这与其显著诱导GSH的积累和提升GSH/GSSG比例有关。Endo等[9]报道了可以通过维持AsA和GSH含量，增强AsA-GSH循环系统的抗氧化能力来提高甜椒果实的耐冷性，这与本研究结果相似。这些结果表明GB处理有利于调节细胞中AsA和GSH的氧化还原状态，维持较高的AsA/DHA和GSH/GSSG比例，从而提高冷藏桃果实的抗氧化能力。

APX、MDHAR、DHAR和GR是AsA-GSH循环代谢中的关键酶。APX能够利用AsA作为电子供体将H2O2还原为H2O，清除细胞中过量的H2O2，同时AsA被催化为单脱氢抗坏血酸（monodehydroascorbate，MDHA）或DHA[33]。MDHAR和DHAR可分别将MDHA和DHA还原为AsA，保证了ASA的高效再生，与此同时GSH被氧化成GSSG[6,34]。GR可利用NAD(P)H作电子供体将GSSG再生成GSH，维持GSH的还原状态[34]。已有研究表明，GB处理可以通过调节植物体内AsA-GSH循环代谢，减轻氧化应激的损伤，提高植物的抗冷性[35]。本研究发现，桃果实冷藏期间GB处理显著上调了AsA-GSH循环中PpAPX、PpGR、PpMDHAR和PpDHAR基因的表达，使得APX、MDHAR、DHAR和GR活性在冷藏期间均维持在较高的水平，这与Song Lili等[11]在低压处理的桃果实中得到的结果类似。在辣椒果实中，GB处理可以提高APX和GR酶活性并诱导相关基因的表达，从而提高抗冷性，减轻低温损伤[24]，这与本实验的研究结果一致。这些结果揭示了GB处理可以调控桃果实冷藏期间AsA-GSH循环中关键酶活性及相关基因表达，提高H2O2的清除能力，同时可以维持果实的AsA和GSH含量，调节AsA/DHA、GSH/GSSG的相互转化来平衡细胞中的氧化还原状态，减轻膜脂过氧化程度，从而延缓桃果实冷害的发生。

4 结 论

GB处理可以有效减轻桃果实的冷害，这与GB处理参与调控AsA-GSH循环系统密切相关。GB处理可通过增加APX、GR、MDHAR和DHAR的活性及关键基因的表达，促进桃果实中AsA和GSH两种非酶抗氧化剂的再生，有效清除积累的H2O2，保持细胞的完整性，减轻桃果实的冷害，增强桃果实的抗冷性。综上，外源GB处理在延长桃果实采后贮藏期及维持果实品质方面具有较好的应用前景。