陈炫宏，嵇 威，董雷超，南希骏，王 猛，孙婉婷，王 赛，周泉城,*

（1.山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255000；2.山东省食品快速分析技术工程实验室，山东 淄博 255049）

高血压（hypertension，HTN）是一种以体循环动脉血压增高为主要特征的临床综合征[1]。1958—2015年间全国HTN抽样调查结果显示，我国成年人HTN总患病率逐年升高趋势明显[2]。并且HTN还可引发其他并发症，其中以脑卒中和心肌梗死最为常见，严重威胁着我国居民的健康[3]。随着对HTN研究的不断深入，已有研究证明血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）与HTN的形成有重要联系[4]，ACE的主要作用是催化血管紧张素I（angiotensin I，Ang I）转化为具有强收缩血管作用的Ang II，从而使心肌收缩力增强，造成血压升高[5]。此外，HTN还可能与肠道微生物有关[6]，多项对HTN大鼠肠道菌群的研究表明，HTN组大鼠肠道菌群的混乱度、丰富度和多样性等与正常大鼠相比均会发生显著变化[7-9]。

近年来，越来越多的研究表明可食用的植物源蛋白酶解液对HTN具有一定的治疗效果，朱玲[10]研究发现豌豆蛋白酶解液具有抑制ACE活性的作用，其中含有2～4 个氨基酸的寡肽效果最好，但未指明其抑制ACE的寡肽组成及与ACE的作用方式。为探明豌豆寡肽（Val-Glu-Pro-Gln，VGPG）对HTN的调节效果及作用方式，本研究在VGPG与ACE分子对接作用机制研究的基础上，对其调节HTN大鼠的血压、血液中血脂、ACE含量以及肠道菌群相关指标进行测定，分析VGPG在HTN调节过程中与ACE活性、肠道菌群之间的关系，旨在阐明VGPG对饮食引起的HTN的作用规律和机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性Wistar大鼠（8 周龄、体质量（200±20）g）由济南金丰实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（鲁）2014-0007。配套标准饲料与垫料由济南金丰实验动物有限公司提供。

VGPG 杭州肽佳生物科技有限公司；非洛地平缓释片 合肥立方制药股份有限公司；马尿酰组胺酰亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、ACE美国Sigma公司；食用盐 湖北长舟盐化有限公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）、脂蛋白a（lipoprotein（a），Lp（a））、ACE免疫分析试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；乙酸乙酯、D-果糖 上海爱纯生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ZH-HX-Z型无创尾动脉血压测量分析系统 安徽正华生物仪器设备有限公司；精密分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MULtiskan型酶标仪 北京澎昆博远科贸发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子对接

1.3.1.1 受体结构准备

ACE蛋白结构从蛋白质数据库（protein data bank，PDB）中获取，PDB代码为1O8A[11]。对蛋白结构进行加氢处理，并将处理后的结构作为分子对接的初始模型，采用AutoDockTools 1.5.6软件进行处理，保存蛋白原有电荷，并生成pdbqt文件用于对接。

1.3.1.2 配体结构准备

构建多肽分子VGPG的三维结构，多肽N端为缬氨酸，C端为谷氨酰胺。由于实验条件pH值为7.4，因此VGPG的N端被质子化，采用MOPAC程序[12]优化分子结构，计算PM3原子电荷[13]，采用AutoDock Tools 1.5.6软件处理配体结构，生成相应的pdbqt文件用于后续对接。

1.3.1.3 分子对接

分子对接采用AutoDock 4.2.6软件包[14]实现，设定1O8A晶体结构中Zn2＋所在的位置为活性位点，将多肽VGPG对接到活性位点，对接盒子的中心坐标设为（36.99，41.25，43.45），XYZ各方向的格点数设为80×60×60 个，格点间距为0.375 Å，对接次数为100 次，其余参数采用默认值。

1.3.1.4 分子对接结果优化

分子对接的结果在空间结构上可能存在不合理的原子接触，可以采用能量优化的方法对这些作用力进行释放，使其更趋于稳定结构。能量优化采用Amber14力场[15]，优化过程分两步进行：先进行5 000 步的最陡下降法优化，再用5 000 步的共轭梯度法对结构进一步优化，将最终的结果作为后续分析的模型。

1.3.2 体外ACE抑制率及酶促动力学分析

体外ACE抑制率实验参考吴建平等[16]的方法并稍作修改，样品采用不同纯度（70%、85%、98%）、不同质量浓度（0.85、1.7、3.4、6.8、12.8 mg/mL）的VGPG。实验在1.5 mL的离心管中进行，每次测定体系的总体积为0.2 mL：含50 mmol/L pH 8.3磷酸盐缓冲液、300 mmol/L NaCl、5 mmol/L HHL、20 μL 0.2 mg/mL的样品。在37 ℃恒温水浴保温5 min，然后加入酶液（0.1 U溶于1 mL相同缓冲液中）启动反应，恒温保持30 min后，加入0.2 mL 1 mol/L HCl溶液终止反应，再加入1.0 mL冷冻后的乙酸乙酯，均匀混合15 s，3 500 r/min离心5 min，取出0.8 mL乙酸乙酯层转入另一试管中，在90 ℃的烘箱中烘干1 h，再将其重新溶于0.8 mL去离子水中，在228 nm波长处测定光密度值。单位酶活力定义为在37 ℃、1 min内催化HHL形成1 μmol马尿酸所用酶量。抑制率按公式（1）进行计算。

式中：OD1为不存在抑制剂时的光密度值；OD2为抑制剂与酶共同存在时的光密度值；OD0为抑制剂与酶都不存在时的光密度值。

酶促动力学实验参考Chen Jiali等[17]的实验方法并稍作修改，固定ACE质量浓度（0.5 mg/mL）不变，分别以不同浓度（0.81、1.62、2.44、3.24、6.48 mmol/L）HHL为底物，并分别添加质量浓度为0.85、3.4、12.8 mg/mL的VGPG（纯度均为98%），同时设空白对照组（不添加VGPG），37 ℃保温准确反应10 min。测定ACE的酶促反应速率（V），平行测定3 次，通过Lineweaver-Burk双倒数法，以1/V-1/[S]作图，并按米氏双倒数方程（公式（2））计算最大酶促反应速率（Vmax）和米氏常数（Km），根据其结果判断VGPG对ACE的抑制作用类型。

式中：υ为产物生成速率/（μg/min）；Km为米氏常数/（mmol/L）；[S]为底物浓度/（mmol/L）；Vmax为最大反应速率/（μg/min）。

1.3.3 高盐、高糖诱导Wistar大鼠HTN模型的建立与分组

本研究模拟自然人群HTN形成过程[18-19]，对大鼠给予含质量分数5% NaCl的高盐饮食和含质量分数20%果糖的高糖饮水。采用大鼠血压心率测定仪每天测压，并进行持续1 周的尾部预温和环境适应训练（将大鼠固定好后等待20 min，使大鼠心率稳定后进行测定），至连续3 d血压收缩压大于140 mmHg并稳定，则视为建模成功。

对建模成功HTN大鼠进行分组，分别为模型组（标记M，生理盐水质量浓度9 g/L）、对照组（标记C，非洛地平缓释片质量浓度0.5 mg/mL）、VGPG高剂量组（质量浓度50 mg/mL）、VGPG中剂量组（质量浓度25 mg/mL）、VGPG低剂量组（质量浓度12.5 mg/mL），同时设立正常组（标记Z，生理盐水质量浓度9 g/L），每组6 只，灌胃剂量5 mL/kgmb，每隔3 d测血压、称质量，灌胃实验持续3 周。

1.3.4 大鼠血清中ACE活性、血脂指标浓度以及脏器指数的测定

血清中ACE活力、血脂指标浓度测定：各组经3 周灌胃实验后，采用眼眶取血法采血，室温静置1 h自然凝固，平衡后3 000 r/min离心10 min，取上清液参照试剂盒说明书测定ACE活力及其他血脂指标（TC、TG、LDL-C、HDL-C、LP（a）、FFA）浓度。

脏器指数测定：灌胃实验结束后解剖大鼠，取出脾脏、肾脏，用滤纸吸干残血后，分别称其质量作为相应脏器指数。

1.3.5 大鼠肠道菌群相关指标测定

3 周灌胃实验结束后处死大鼠并将其解剖，之后在无菌环境下取大鼠肠道粪便贮于灭菌EP管中并密封保存，置于液氮中备用。后将样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行肠道菌群α-多样性分析、菌群群落分析、Heatmap分析。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，Origin 2018软件作图，实验数据用平均值±标准差表示，显著性分析采用单因素方差分析法，差异性显著水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 VGPG与ACE的结合模式分析

通过将VGPG对接到ACE的活性位点，可以深入研究二者的结合模式。分子对接得到的结合能为－26.03 kJ/mol，对接结果如图1所示，可以看出多肽分子VGPG能够结合在ACE的活性位点，并且由于VGPG结构中具有较多的氢键供体和受体，与ACE活性位点的氨基酸残基形成了较强的亲水相互作用。因此，分子对接结果初步表明，VGPG能够与ACE结合并具有较强的亲和力，其中氢键相互作用可能对于二者的结合具有重要的贡献。

图1 VGPG分子结构（A）及VGPG与ACE活性位点的结合（B）Fig. 1 Molecular structure of VGPG (A) and binding of VGPG to the active site of ACE (B)

VGPG与ACE结合模式如图2所示。参与二者结合的氨基酸残基主要有Ala356、Pro407、Val518、Arg522、Tyr523以及Zn2＋，其中VGPG与Ala356和Arg522能够形成氢键，而VGPG的C末端羧基与Zn2＋形成了金属配位键，从而起到抑制ACE作用，这与Cheung等[20]的研究结果一致。表明VGPG主要通过氢键作用以及与Zn2＋的配位作用与ACE的活性位点结合，对ACE起竞争性抑制作用，从而抑制ACE的活性。

图2 VGPG与ACE的结合模式Fig. 2 Binding pattern of VGPG to ACE

2.2 VGPG对ACE抑制率及酶促动力学分析结果

由图3A及表1可知，VGPG在不同质量浓度下的Lineweaver-Burk倒数图为近似相交于Y轴的一组直线，其中截距1/Vmax约为1.58 min/μg，Km随着VGPG质量浓度的增大而增大，表明其对ACE的抑制模式为竞争性抑制。

表1 VGPG对ACE抑制作用的Lineweaver-Burk曲线方程Table 1 Lineweaver-Burk curve equations of VGPG at different concentrations for ACE inhibition

由图3B VGPG对ACE体外抑制实验结果可知，不同纯度VGPG对ACE的抑制率具有明显差异。VGPG纯度70%、85%、98%的半抑制质量浓度分别为2.30、1.15、0.75 mg/mL，表明VGPG的纯度越高对ACE的抑制效果越好，两者呈正相关关系。此外，在相同纯度下，随着VGPG质量浓度的增加，其对ACE的抑制率呈现先上升后下降的趋势，且当VGPG纯度为98%、质量浓度为3.4 mg/mL时抑制率最大，达到77.4%，与Nawaz等[21]所制备的酶解豌豆肽研究结果相似。这是由于当VGPG质量浓度较低时，随着浓度升高，VGPG竞争结合ACE活性位点能力提高，从而对ACE抑制效果显著提升；而当VGPG质量浓度较高时，由于ACE活性位点处结合的VGPG达到饱和，VGPG的竞争结合ACE活性位点能力降低，并且由于VGPG的结构中含有较多的氢键供体和受体，其在高质量浓度下会通过静电作用相互影响，从而表现出对ACE抑制效果增长缓慢甚至是下降现象。这与前文VGPG对ACE分子结合模式为竞争性抑制作用的结论一致。

图3 VGPG的酶促动力学（A）和不同纯度VGPG对ACE抑制率（B）Fig. 3 Enzymatic kinetics of VGPG (A) and inhibitory rates of ACE by VGPG of different purities (B)

2.3 VGPG对HTN大鼠血压和体质量的影响

如图4所示，在HTN模型建立期间，Z组大鼠血压维持在100～120 mm Hg之间，其余实验组大鼠的血压明显上升并维持在140 mm Hg以上，证明HTN模型建造成功。同时，Z组大鼠在持续灌胃期间血压稳定，表明实验室饲养环境对大鼠血压无明显影响。药物干预后，灌胃实验结束时C组大鼠血压明显降低，与治疗前相比血压降低了19.0%；VGPG各剂量组血压也有不同程度的下降，其中VGPG中剂量组下降程度最大，达到15.8%，低剂量组与高剂量组分别下降11.6%和9.3%。说明中剂量的VGPG降压效果最好，与图3B体外模拟抑制实验结果相印证，表明降压效果不是单纯地随着VGPG质量浓度的提高而提升，间接证明VGPG是通过竞争性抑制ACE活性的方式来降低血压。

图4 VGPG对HTN大鼠血压的影响Fig. 4 Effect of VGPG on blood pressure of HTN rats

由图5可知，在整个持续灌胃期间M组大鼠体质量持续增加，并且显著高于Z组，C组与VGPG各剂量组同样显著上升，符合高盐高糖饮食所致HTN患者的生理特征[22]，间接证明了实验建模成功。在给予非洛地平缓释片与VGPG后，与灌胃实验开始时相比，C组与VGPG各剂量组大鼠体质量在灌胃期间均呈现不同程度的下降，灌胃结束时下降幅度为VGPG中剂量组最高，达到10.3%；C组次之，达到5.4%。这与对应各组大鼠血压变化趋势相似，表明HTN对体质量具有一定的影响，且VGPG有助于缓解由于高盐高糖饮食所导致的肥胖，对降低血压具有积极作用。

图5 VGPG对HTN大鼠体质量的影响Fig. 5 Effect of VGPG on body mass of HTN rats

2.4 VGPG对HTN大鼠血清ACE活力的影响

如图6所示，M组HTN大鼠血清中ACE活力最高，达到897 mU/mg，而Z组大鼠血清中ACE活力为511 mU/mg，两者之间具有显著差异（P＜0.05），表明血清中ACE活力显著增加是诱发HTN的一个重要因素[23]。与Z组相比，C组大鼠血清中ACE活力无显著差异（P＞0.05），同时VGPG各剂量组大鼠血清中ACE活力与Z、M组相比具有显著差异（P＜0.05），其中VGPG中剂量组与正常大鼠ACE活力最为接近，证明通过抑制大鼠血清中ACE活力是VGPG降压的一条途径，且中剂量的VGPG抑制效果最好。

图6 VGPG对HTN大鼠血清ACE活力的影响Fig. 6 Effect of VGPG on ACE activity in serum of HTN rats

2.5 VGPG对HTN大鼠血清中血脂的影响

由表2可知，M组较Z组血脂中各项指标均发生不同程度的变化，6 项血脂浓度均低于Z组；C组大鼠血脂中HDL-C、LP（a）、LDL-C浓度与Z组之间无显著差异（P＞0.05），TG浓度显著低于Z组而高于M组，TC、FFA浓度高于Z组（P＜0.05），表明药物对血脂变化有积极作用，这与文献[24]报道一致；与Z组相比，VGPG中、低剂量组大鼠血脂中TG、FFA浓度具有显著差异（P＜0.05），VGPG中剂量组大鼠血脂中其余成分与Z组相比无显著差异（P＞0.05），其变化趋势与C组相似，表明VGPG与HTN药物对血脂成分的影响作用效果相似。值得注意的是，VGPG各剂量组中VGPG中剂量组的血脂各项指标浓度相较于其他两组与Z组更为接近，因此，中剂量的VGPG对大鼠HTN调节具有更好的效果，而且VGPG对于大鼠HTN的作用效果并不是单纯随着浓度的升高而增加，这与前文的研究结果相同。

表2 HTN大鼠血脂组成成分浓度Table 2 Blood lipid levels in HTN rats

2.6 VGPG对HTN大鼠脏器指数的影响

由表3可知，M组HTN大鼠的脾脏指数显著高于Z组（P＜0.05），VGPG低、高剂量组脾脏指数与M组无显著差异，C组、VGPG中剂量组脾脏指数与Z组无显著差异（P＞0.05）；对肾脏指数而言，各组相对Z组均显著降低（P＜0.05），但其中VGPG中剂量组肾脏指数与Z组最为接近。结果表明，HTN会对肾脏、脾脏器官产生一定的影响，而VGPG对此具有一定的治疗和调节作用，且中剂量的VGPG效果最好，与文献[25]报道一致。

表3 VGPG对HTN大鼠脏器指数的影响Table 3 Effect of VGPG on spleen and kidney indices in HTN rats

2.7 VGPG对大鼠肠道菌群的影响

2.7.1α-多样性分析结果

对大鼠肠道菌群进行物种α-多样性分析，结果如图7所示。M组Sobs指数较Z组显著降低，表明由高盐高糖引发的HTN会降低肠道菌群的多样性，这与文献[26]研究结果一致；对大鼠给予非洛地平缓释片与VGPG治疗后，C组菌群丰富度有显著提升，说明药物对肠道菌群的多样性具有显著影响；VGPG低、中剂量组菌群丰富度显著高于M组，分别高出122.7%、51.1%，且菌群丰富度随着VGPG质量浓度的增加而呈现明显下降趋势，说明较低质量浓度的VGPG有利于菌群生长，但质量浓度太高则会选择性地导致某些肠道菌群减少或消失，且这种作用随VGPG质量浓度增加而增强。需要注意的是，尽管VGPG低剂量组粪便菌群丰富度最高，但VGPG中剂量组丰富度与Z组最为接近，表明中剂量的VGPG具有改善因HTN而造成的菌群丰富度与多样性下降的能力，从而使肠道菌群微环境维持在正常范围之内，进而起到降压的效果。

图7 大鼠肠道菌群Sobs指数Fig. 7 Sobs index of intestinal flora in rats

如图8A所示，Sobs稀释曲线趋于平缓，说明测序数据达到饱和，能够覆盖大鼠肠道微生物组群落的绝大部分物种。且Sobs指数中C组最高，之后依次为VGPG低剂量组、VGPG中剂量组、Z组，M组与VGPG高剂量组Sob指数均低于正常大鼠，VGPG中剂量组与Z组最接近，表明其与正常大鼠的菌群丰富度最相似。

图8 大鼠肠道菌群稀释曲线（A）和Shannon曲线（B）Fig. 8 Rarefaction curve (A) and Shannon (B) curves of intestinal flora in rats

Shannon指数能够反映菌群的多样性[27]，由图8B可知，M组相较于Z组，多样指数明显降低，说明HTN会降低肠道菌群的多样性；C组与Z组相近，说明药物基本不会影响肠道菌群的多样性；VGPG低剂量组与中剂量组HTN大鼠肠道菌群的多样性与Z组接近，而高剂量组明显低于Z组。表明由高盐高糖所引发的HTN会明显改变生物肠道中菌群的丰富度与多样性，低、中剂量的VGPG对HTN患者肠道菌群有一定的改善作用。

2.7.2 门水平上大鼠肠道菌群群落分析结果

目前已有研究表明厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）之比（F/B）可以反映肠道菌群紊乱程度[8]。由图9可知，Z组、M组、C组、VGPG高剂量组、VGPG中剂量组、VGPG低剂量组F/B分别为3.27、0.65、5.89、4.54、4.88、6.24。M组肠道菌群的紊乱程度最低，而VGPG低剂量组最高。其原因可能是由于通过高糖高盐饮食所引发的HTN会使肠道中菌群的丰富度降低，从而使HTN大鼠肠道菌群的紊乱程度相对降低，同时也表明药物会增加肠道菌群的紊乱程度，对其造成不良影响。结合Heatmap图（图10）进行样本聚类分析，在门水平上大鼠肠道各菌群分布M组与Z组差别最大，VGPG剂量组中1组与Z组最为接近，证明VGPG对HTN大鼠肠道菌群具有改善效果。

图9 门水平大鼠肠道菌群群落分析Fig. 9 Intestinal flora community analysis of rats at the phylum level

图10 门水平大鼠肠道菌群Heatmap图Fig. 10 Heatmap of the intestinal flora of rats at the phylum level

2.7.3 科水平上大鼠肠道菌群群落分析结果

如图11、12所示，在科水平上，与Z组相比，M组中产短链脂肪酸菌科（Prevotellaceae）所占比例明显上升，产乙酸、丁酸等菌科（Lachnospiraceae）所占比例明显下降，存在肠道菌群失衡现象。表明HTN大鼠肠道菌群中产短链脂肪酸细菌数量增加，而产乙酸、丁酸细菌数量减少，这与文献[8]的研究结果相同。肠道菌群与血脂成分分析结果表明，肠道微生物影响血压的机制之一可能是通过其分泌物（如短链脂肪酸等）影响大鼠血脂成分，进而对血压产生一定的影响，这与Felizardo等[28]的研究结果一致。使用非洛地平缓释片和VGPG干预后，C组与VGPG各剂量组Prevotellaceae与Lachnospiraceae占比接近正常大鼠，但C组中螺旋体科（Spirochaetaceae）比例上升，其所属菌属（如密螺旋体属、疏螺旋体属以及钩端螺旋体属等）均具有较强的致病性，并且已有多项研究表明，Spirochaetaceae会导致疾病的发生和传播[29-30]。本实验中C组的Spirochaetaceae比例上升，尽管未表现出明显的疾病症状，但仍增加了大鼠患病的潜在风险；VGPG各剂量组中Lactobacillaceae比例明显上升，此菌类与糖类物质代谢分解有关，其所属绝大多数菌属（如乳酸菌、植物乳杆菌等）均具有较强的分解糖类物质的能力，可以将葡萄糖、果糖等物质分解为乳酸，属益生菌[31]。因此，VGPG各剂量组中Lactobacillaceae比例明显上升，使得大鼠肠道对诱发HTN病因之一——果糖的分解能力大大提高，从而对缓解、治疗HTN疾病产生良好的作用。大鼠肠道菌群分析结果表明，对照组药物可能在治疗HTN的过程中对肠道菌群产生一定的副作用，而VGPG对菌群无明显副作用，并且对改善肠道菌群具有积极作用。

图11 科水平大鼠肠道菌群群落分析Fig. 11 Intestinal flora community analysis of rats at the family level

图12 科水平大鼠肠道菌群Heatmap图Fig. 12 Heatmap of the intestinal flora of rats at the family level

3 结 论

本研究表明VGPG对HTN疾病具有显著的治疗效果，在21 d的HTN大鼠灌胃干预实验中，纯度为98%、质量浓度为25 mg/mL的VGPG具有最好的降压效果，并且VGPG还可缓解由HTN所引起的肥胖；与常规降压药物相比，VGPG对肾脏、脾脏器官以及肠胃微生态环境无明显副作用。VGPG在体内存在两种降压机制：1）通过与ACE活性位点相结合，对其活性产生竞争性抑制从而达到降压的作用；2）通过调节肠道微环境，使菌群丰富度和多样性维持在正常范围以内，同时提高菌群对糖类物质的分解能力，减少因肠道微生物紊乱而对大鼠血压造成的不良影响。这两种调节方式之间是否存在关系还有待进一步研究。综上所述，本研究从分子对接、体外、体内3 个层面，探索性地研究了VGPG对大鼠HTN的抑制效果和机制，揭示肠道菌群、ACE活性与HTN的关系，结果表明VGPG可被用作治疗HTN的功能性因子，可用于相关功能性食品的制备。