赵 晓，徐境含，崔东影，徐珒昭，刘 洋，滕国新，许晓曦,*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.武警工程大学装备管理与保障学院，陕西 西安 710086；3.黑龙江飞鹤乳业有限公司，北京 100015；4.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 011500）

近年来，炎症性肠炎（inflammatory bowel disease，IBD）已经成为重要的全球性健康问题。IBD患者最普遍的特征是肠道黏膜发炎且反复发作，常伴有腹痛和腹泻，往往还伴随心血管疾病、心理及精神疾病、代谢综合征等疾病，进一步恶化会导致结直肠癌。1990—2017年，全球IBD患者由370万上升到680万[1-2]，这些变化已使得IBD成为全球需要共同面对和解决的重大问题。IBD患者也往往伴随患有肠道菌群失调，通常表现为肠道菌群多样性下降、共生菌和致病菌群比例失调等[3-4]。肠道菌群通过自身成分、代谢物和衍生物以及致病菌共生菌移位等机制，参与调控宿主的代谢、免疫，从而影响罹患IBD等疾病的风险[5]。通过营养干预来调控肠道菌群，塑造肠道黏膜屏障的结构和功能，维持肠稳态，被证明可以治疗和预防某些疾病[6]，同样也可以通过营养干预来降低IBD风险[7-8]。

乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种铁结合糖蛋白，具有多种生物活性[9-10]。目前，LF已成为婴儿配方奶粉的主要功能性添加成分，且在婴幼儿健康中的影响已有大量研究[11-14]。一些临床研究结果表明，与喂养婴儿配方奶粉的早产儿相比，喂养母乳可以显著降低约13%的新生儿坏死性结肠炎的发生率和死亡率[15-18]，原因被归结为母乳中含有的以LF为代表的生物活性成分对预防和治疗IBD的有益作用[19-20]。LF还可以调节肠道菌群、抑制有害菌生长及在肠道中的定植、促进益生菌生长[21-22]。但LF对IBD疾病的预防和辅助治疗作用鲜见报道，尤其是LF对IBD肠道微生态的系统性研究还缺乏相关数据。本研究采用16S rRNA测序技术探究LF对IBD模型大鼠肠道菌群多样性及丰度的影响，重点分析LF对肠道微生态中益生菌、潜在有害菌的促进或抑制作用，以期为LF作为营养添加剂在IBD的辅助治疗中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级SD大鼠（雄性、4 周龄、体质量90～110 g）购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。全部动物饲养于东北农业大学实验动物房中。饲养条件：室温（25±2）℃、光暗周期12/12 h，标准鼠盒饲养，5 只一盒，下垫灭菌垫料。大鼠可自由走动、摄食及饮水。所有的实验操作都得到东北农业大学动物道德委员会批准。

牛LF 美国Hilmar Ingredients公司；葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）（36 000～50 000 Da）大连美仑生物技术有限公司；盐酸小檗碱（berberine hydrochloride，BBH） 东北制药集团沈阳第一制药有限公司。

1.2 仪器与设备

VD-1320型无菌操作台 北京东联哈尔仪器制造厂；DW-86L490J型－80 ℃超低温冰箱 青岛海尔集团；电子显微镜 德国卡尔蔡司股份公司；NanoDrop 2000微量紫外分光光度计 美国Thermo Fisher公司；GeneAmp®9700型基因扩增聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Life ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立

将SD大鼠适应性饲养7 d后，随机分为6 个组，每组10 只，进行给药。

配制含3 g/100 mL DSS的饮用水供大鼠自由饮用，以建立实验性结肠炎模型SD大鼠[23]。每天对大鼠进行监测，以确保它们摄入约等量的DSS水溶液，对照组给予生理盐水，不加DSS。DSS刺激7 d后，低、中、高剂量组分别灌胃20、50、100 mg/kgmb的LF。BBH是一种异喹啉生物碱，又称黄连素，临床主要用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等肠道感染。分别以经DSS诱导后灌胃生理盐水和50 mg/kgmbBBH组作为阴、阳性对照，分别标记为DSS组和BHH组。DSS致结肠炎第7天随机选取对照组和实验性结肠炎模型组各2 只大鼠处死，从盲肠至肛门上方1 cm处切除结肠，用苏木精-伊红染色，根据染色结果观察肠道黏膜损伤情况。

1.3.2 疾病活动指数评分

DSS刺激7 d期间，每天监测大鼠的体质量并进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分。DAI评分由对上述治疗方法不知情的观察者进行，通过综合体质量减量、粪便出血和粪便黏稠度进行评分[24]。体质量减量为原体质量（第1天）与第7天体质量的差值与原体质量之比（0：无变化；1：≤5%；2：6%～10%；3：11%～20%；4：≥20%）。粪便出血评分标准为0：无便血；1：粪便中可见血丝；2：粪便中可见血迹；3：粪便中明显带血；4：全直肠出血。粪便稠度评分标准为0：正常；1：柔软但仍然成形；2：非常柔软；3：腹泻一半；4：腹泻。

1.3.3 苏木精-伊红染色

将多聚甲醛固定的结肠组织用石蜡包埋，经切片、展片、烤片，然后进行苏木精-伊红染色，最后使用电子显微镜获得显微照片。

1.3.4 大鼠肠道菌群多样性分析

大鼠处死后无菌收集结肠粪便，贮存在－80 ℃冰箱中备用。粪便DNA提取采用Bio Teke粪便DNA试剂盒并按照说明书进行。用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计对分离的DNA进行纯度和浓度测定，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA纯度。使用338 F（5’-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3’）和反向引物806 R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对V3～V4可变区进行PCR扩增。扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，27 个循环；72 ℃延伸10 min。然后送至上海美吉生物医药科技有限公司，利用Miseq PE300平台进行测序。

1.3.5 生物信息学分析

原始测序序列使用Trimmomatic软件进行质控，使用FLASH软件进行拼接。采用UPARSE 7.1软件（http://drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP Classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123）。所有的生物信息学分析均在上海美吉生物集团生物信息分析云平台上进行。

1.4 数据处理与分析

采用Sigmaplot软件进行数据处理及作图。实验结果采用同组个体测定结果的平均值±标准差表示（n＝10）。采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析，以P＜0.05判断差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 IBD大鼠模型验证

为确保本研究中SD大鼠IBD模型成功建立，检测了DSS建模期间大鼠体质量、DAI评分变化，并在建模结束后观察结肠黏膜表观形态。

由图1A可知，DSS建模期间大鼠体质量直线下降，对照组大鼠体质量缓慢上升。DSS建模第1天大鼠体质量呈现较低（小于3%）的上升趋势，与对照组相比无明显差异。随着DSS作用时间延长，大鼠表现出进食量减少、腹泻等现象，体质量下降明显，而未受DSS刺激的对照组大鼠体质量持续上升。

DAI是评价结肠炎的重要指标，主要从体质量减量、粪便性状及便血程度3 个方面对肠炎进行评估。由图1B可知，DSS刺激的大鼠，其DAI评分逐渐升高，与对照组差异显著（P＜0.05）。DSS刺激第3天之后，DAI评分急速升高。实验发现，大鼠在DSS刺激第3天开始粪便不成型，第4天开始有便血，而后便血明显，部分大鼠出现稀水便。这说明DSS刺激7 d能够造成大鼠产生肠炎症状。对照组大鼠在建模的最后2 d，个别出现腹泻的现象，这可能是灌胃所带来的应激反应。

图1 DSS建模期间大鼠体质量（A）和DAI评分（B）变化Fig. 1 Changes in body mass (A) and DAI score (B) of rats during DSS administration

DSS刺激7 d后，解剖大鼠，取结肠进行苏木精-伊红染色，观察其结构形态。由图2可知，对照组大鼠结肠具有完整的黏膜以及健康的隐窝结构，并且富含杯状细胞。而DSS组表现出严重的结肠黏膜损伤，黏膜肌层消失，黏膜下层和浆膜发炎，中性粒细胞浸润。肠道上皮细胞受到严重破坏，杯状细胞减少，隐窝和绒毛结构消失，腺体组织混乱。综上，从大鼠体质量、DAI评分及结肠黏膜形态3 个指标可以看出，DSS刺激IBD大鼠模型成功构建。

图2 DSS建模后大鼠结肠黏膜形态显微图Fig. 2 Morphological structures of colon after DSS stimulation

2.2 LF摄入对肠道菌群种类多样性的影响

α-多样性是指一个特定区域内的多样性，常用Chao1、Ace、Simpson等一系列指数来度量，通过多样性分析可以得到物种的多样性信息。本研究采用Ace、Sobs、Simpson、Coverage指数以评估LF对IBD大鼠肠道菌群α-多样性的影响。

Ace指数和Sobs指数能够反映样本所含OTU的数目，即对样本微生物种类的评估，其数值越高，说明样本所含微生物种类越丰富。由图3A、B可知，与对照组相比，DSS刺激的大鼠，其Ace、Sobs指数均降低，而与DSS组相比，LF灌胃大鼠这两个指数均有不同程度的升高。与DSS组相比，低剂量LF组对Ace、Sobs指数影响不显著（P＞0.05），中、高剂量组这两个指标均显著提高（P＜0.05），说明LF剂量与结肠炎大鼠肠道菌群多样性呈正相关。与BHH组相比，高剂量组提高了Ace、Sobs指数，但对Sobs指数的影响不显著（P＞0.05），这说明LF比BHH更有助于肠道菌群多样性的恢复。但与未受到DSS刺激的对照组大鼠相比，LF灌胃组的大鼠Ace、Sobs指数均较低，但高剂量组与对照组无显著性差异（P＞0.05）。

Simpson指数用来估算样本中微生物多样性，Simpson指数越高，说明群落多样性越低。由图3C可知，DSS刺激的大鼠群落多样性降低，与DSS组相比，LF灌胃的大鼠群落多样性升高。这说明，DSS刺激降低了大鼠肠道的菌群多样性，但LF有助于恢复大鼠肠道的菌群多样性。BHH组Simpson指数图中箱形面积较大，说明该组大鼠个体差异较大，可能是因为不同个体对BHH的耐受不同。与对照组相比，LF灌胃的大鼠，Simpson指数无显著差异（P＞0.05）。

Coverage指数越高，则样本中序列被测出的概率越高，反映测序结果是否代表样本中微生物的真实情况，可以评价物种种类的覆盖率。由图3D可知，各组大鼠Coverage指数均高于0.99，说明实验结果可以真实反映大鼠肠道菌群的组成和分布，数据有效。α-多样性指数结果说明，DSS刺激造成了大鼠肠道菌群种类的降低，而灌胃LF后，肠道菌群多样性得到恢复，且LF高剂量组的α-多样性指数与健康大鼠无显著差异（P＞0.05）。

图3 摄入LF对结肠炎大鼠α-多样性的影响Fig. 3 Effect of LF intake on α-diversity of gut microbiota in rats with colitis

2.3 LF摄入对IBD大鼠肠道菌群组成的影响

肠道菌群的组成会影响机体的肠稳态，进一步会影响机体的整体健康。本研究从门和科水平考察了LF对IBD大鼠肠道菌群种类和丰度的影响。作为肠道菌群的两大优势菌，厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）的比例失调与多种疾病相关，而IBD患者的肠道菌群特征之一就是厚壁菌门/拟杆菌门比例降低。由图4A可知，DSS刺激下大鼠肠道菌群厚壁菌门/拟杆菌门比例与对照组相比降低了79.6%，而LF低、中、高剂量组分别提高厚壁菌门/拟杆菌门比例至119%、223%和380%，分别是对照组的23%、43%和74%。LF中、高剂量组对厚壁菌门/拟杆菌门比例的提高比BHH组分别高22.1%和230.8%。这说明LF比BHH更有助于恢复DSS刺激所引起的大鼠结肠肠道菌群优势菌——厚壁菌门和拟杆菌门的失调。

肠道菌群多样性科水平分布如图4B所示，大鼠肠道菌群科水平的优势菌群为乳杆菌科（Lactobacillaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）等。与对照组组相比，DSS刺激下大鼠结肠中乳杆菌科（32% vs. 12%）、瘤胃菌科（34% vs. 17%）等菌群相对丰度降低，同时拟杆菌S24-7（7.8% vs. 28%）、毛螺旋菌科（17% vs. 22%）、普雷沃氏菌科（3% vs. 13%）等菌群相对丰度增加。与DSS组相比，LF高剂量组提高了乳杆菌科（12% vs. 40%）、瘤胃菌科（17% vs. 27%）等菌群的相对丰度，降低了拟杆菌科（28% vs. 8%）、普雷沃氏菌科（13% vs. 6%）等菌群的相对丰度，且部分呈现出一定的剂量依赖关系。同时，相对于DSS组，BHH组也呈现与LF相似的作用。值得一提的是，DSS组的独有菌群是促炎菌科（Erysipelotrichaceae），这可能是造成IBD的原因之一。

图4 大鼠肠道菌群门水平（A）和科水平（B）物种组成Fig. 4 Dominant flora and species composition in rat colon at phylum (A)and family (B) level

采用Venn图统计不同组别大鼠肠道菌群所共有和独有的物种数目（OTU水平）。如图5所示，6 组大鼠肠道菌落所共有的物种数目为346 个。对照组大鼠的物种数最高，为648 个，其次为LF高剂量组，有632 个，而BHH组OTU数目为606 个。DSS组OTU数目为573 个，比对照组OTU数目少11.6%。对照组和LF高剂量组所独有的物种数目分别为41 个和20 个，DSS组有12 个独有物种。与DSS组相比，LF低、中剂量组对物种OTU数目影响不大，但LF高剂量组物种OTU数目提高了10.3%。OTU数目的大小也从另一方面说明了菌群的多样性，结果表明对照组健康鼠的肠道菌群多样性最丰富，而DSS组和LF低剂量组菌群多样性最低，LF中、高剂量有助于提高菌群多样性水平，且LF高剂量组菌群多样性和对照组组最接近，这一结果和α-多样性结果相一致。

图5 大鼠肠道菌群物种差异性分析Venn图Fig. 5 Venn diagram showing differences in gut microbiota composition among rats in different groups

2.4 摄入LF对IBD大鼠肠道菌群KEGG信号通路相关OTU丰度的影响

通过KEGG信号通路的功能分析，所有OTU被注释到254 种信号通路中。通过对这些信号通路的功能性进行分类汇总，然后选出影响机体健康并与本研究关联性较大的12 种信号通路，结果见表1。

表1 摄入LF对IBD大鼠肠道菌群KEGG信号通路相关OTU丰度的影响Table 1 Effect of LF intake on the abundance of OTU related to KEGG signaling pathway in intestinal microbiota of IBD rats

同一种KEGG信号通路下不同组大鼠的OTU丰度差异明显。从与人类疾病相关的3 种信号通路（癌症、感染性疾病和神经退行性疾病）所对应的OTU丰度可以明显看出，DSS组所对应的OTU丰度最高，而LF中、高剂量组和对照组差异较小。这说明IBD患者同时罹患癌症、感染性疾病等其他疾病的风险较高。器官相关KEGG信号通路中，免疫系统和神经系统的OTU丰度在DSS组分布最高，而随着LF剂量的升高，其对应的OTU丰度逐渐下降，其趋势和人类疾病相关的信号通路OTU丰度分布相似。但消化系统相关KEGG信号通路的OTU丰度在DSS组分布较低。代谢功能相关KEGG信号通路的OTU丰度在DSS组相对较高，尤其是运输和分解代谢对应的OTU丰度最高。与代谢功能相关的KEGG信号通路对应的OTU丰度在不同组大鼠肠道菌群中的分布规律类似，细胞及遗传信息相关的KEGG信号通路对应的OTU丰度在DSS组大鼠中分布最高，LF低剂量组应对的OTU丰度次之，LF高剂量组对应的OTU丰度较低，BHH组对应的OTU丰度最低。这可能是因为IBD患者氧化应激水平高，导致与细胞相关的菌群丰度增加[25]。通过对菌群KEGG通路OTU丰度的分析可以看出，IBD也会伴随其他疾病的发生[26]。

3 讨 论

肠道菌群对多种疾病，尤其是对消化道类疾病的影响近十几年受到广泛关注。肠道菌群通过其组成与代谢物影响肠道基因表达调控通路变化，而且这种靶向调节作用可能存在精细复杂性与通路特异性。IBD患者肠道菌群个体差异较大，但目前广泛接受的认知是IBD疾病常伴随肠道厚壁菌门的数量下降，同时产生内毒素的变形杆菌（Proteobacteria）数量增加[27]。IBD患者肠道菌群种类下降，大多数是因为厚壁菌门类细胞减少。其中，梭状芽孢杆菌（Clostridium leptum），尤其是普雷沃氏杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）下降。但是不同研究的肠道菌群分布差异很大，尤其是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、拟杆菌属（Bacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacteriasp.）、乳杆菌属（Lactobacillussp.）以及大肠杆菌（Escherichia coli）[28]。本研究结果并没有检测到双歧杆菌属（Bifidobacteriasp.）和大肠杆菌。这可能是由取样部位、样品是否取自被感染部位、疾病严重程度、来源于肠道和粪便之分以及分析肠道菌群所用的方法等差异造成的[29]。肠道菌群的取样部位和取样时间对结果影响很大，如粪便和肠黏膜中的肠道菌群组成差异很明显[30]。黏膜菌群能更准确地反映机体紊乱状态[31]，甚至有报道称IBD患者肠黏膜菌群数量比健康人多[32]。推测可能是黏膜上的菌群与肠道表面接触密切，因此，黏膜相关菌群在生理功能上比肠腔内菌群影响更大[32]。本研究肠道菌群样本取自大鼠结肠内容物，采用16S rRNA高通量测序，结果表明LF可以恢复患IBD大鼠肠道菌群的种类，提高厚壁菌门数量，降低拟杆菌门数量，这和文献[33-34]一致。研究结果表明DSS组大鼠结肠拟杆菌科丰度增加，DSS组的独有菌群是促炎菌科Erysipelotrichaceae，这可能是导致肠道炎症出现的原因之一。Earley等[35]报道S24-7细菌数量的降低和肠道完整性下降以及肠道菌群移位有关。乳杆菌属（Lactobacillus）是肠道益生菌的主要菌属，益生菌可以促进大鼠小肠隐窝上皮细胞增殖、延长上皮细胞的寿命、维护肠黏膜屏障功能的完整性，还可以调节结肠黏液层，平衡肠道黏膜免疫[9]。毛螺旋菌（Lachnospiraceae）能将多糖降解为乙酸、丁酸等短链脂肪酸，短链脂肪酸可以被肠道上皮细胞迅速吸收，并参与细胞增殖和调节过程，此外，短链脂肪酸还可以调节先天免疫和适应性免疫细胞的产生、运输，影响免疫细胞的功能性。丁酸还可以直接作用于黏膜细胞，增加调节性T细胞的数量并增强其活性，同时抑制中性粒细胞、巨噬细胞、效应T细胞等的活性，产丁酸菌群的减少可以激发IBD患者菌群失调，引起肠道黏膜炎性细胞的显著增加[36]。拟杆菌属（Bacteroides）的细胞表面脂蛋白BtuG2能结合VB12，并可以从VB12的关键转运蛋白内在因子中竞争性结合VB12，这意味着拟杆菌属可以争夺肠道中的关键维生素；此外，拟杆菌还与多种疾病相关，如结肠直肠癌、肝病[37]。

LF能够恢复IBD大鼠结肠粪便肠道菌群的α-多样性分布，提高优势菌厚壁菌门，降低拟杆菌门丰度。同时，LF通过提高有益菌乳杆菌、瘤胃菌科，降低拟杆菌、普雷沃氏菌的丰度，从而正向调节患IBD大鼠肠道微生物组成，维持肠稳态。此外，LF还通过降低大鼠肠道菌群与癌症、感染性疾病等疾病相关信号通路OTU丰度，来降低其他疾病风险。