巩 雪，常 江，李丹婷，孙智慧

（1.哈尔滨商业大学轻工学院，黑龙江 哈尔滨 150028；2.哈尔滨商业大学教务处，黑龙江 哈尔滨 150028）

扇贝是扇贝属双壳类软体动物的代称，是我国沿海主要养殖贝类之一[1]，据统计，中国贝类产量为1 447.36万 t，其中扇贝产量为186.05万 t[2]。扇贝的贝壳和珍珠层具有很高的利用价值，而扇贝的贝肉特别是闭壳肌（瑶柱）味道鲜美，富含多种人体所需的氨基酸、微量元素（钙、锌、硒和碘等）、蛋白质、牛磺酸和多种不饱和脂肪酸，特别是ω-3多不饱和脂肪酸（主要是二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸）含量相当高[3-4]，可以使肝脏中的载脂蛋白B和甘油三酯合成胆固醇的效率降低，改善人体的脂质代谢[5]，具有较高的营养价值和保健功效[6-7]，故与海参、鲍鱼齐名，被列为海味中的珍品[8]。随着人们生活水平的提高，扇贝也受到越来越多消费者的青睐[9]，作为中国重要的海洋经济养殖贝类，扇贝主要以活品形式流通，部分以闭壳肌为主的即食与干制加工品形式流通[10]；因此脱壳工艺在生产过程中显得尤为重要。然而，当前我国贝类脱壳加工仍以手工操作为主，效率低下，卫生亦不达标；欧美等发达国家应用较多的超高压脱壳技术表现出良好的优越性，因而备受关注。但超高压脱壳技术依然存在脱壳效率稳定性低、贝肉品质均一性差等问题，且该技术的脱壳机理至今尚未明确，因此，展开超高压作用对扇贝界面闭壳肌（贝壳与闭壳肌接触面以上2 mm厚度的闭壳肌段）结构的影响及脱壳机理的研究与探讨是极为必要的。

1 材料与方法

1.1 材料

以辽宁沿海盛产的海湾扇贝为实验对象，扇贝购买于辽宁省锦州市渤海大学海鲜市场，由于超高压腔室入口直径的限制，不宜选择体积过大扇贝，但需尽量挑选大小相近的个体，扇贝质量为（48±5）g，最长轴直径为（97±5）mm。

1.2 仪器与设备

HPP.L2-600超高压处理设备 天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司；S-4800场发射扫描电子显微镜 日本日立公司；LabRAM HR Evolution拉曼光谱分析仪 法国HORIBA Jobin Yvon公司；ALPHA1-2LD plus冷冻干燥机 德国Martin Christ公司；H1850高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PL602-L分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 试样处理

将所购买的扇贝表面清洗干净，在聚乙烯包装袋（200 mm×150 mm）内注入50 mL 3 g/100 mL NaCl溶液后，放入1 个扇贝并封口，再将密封好的扇贝置入超高压处理设备，分别以100、200 MPa和300 MPa的实验压力进行处理（每个处理30 个扇贝），保持2 min后取出，分离扇贝贝壳与闭壳肌后，测定脱壳率和界面闭壳肌结构，每次测定进行3 次平行实验，并取平均值。

1.3.2 脱壳率测定

对经过超高压处理（100、200、300、400 MPa处理不同时间）的扇贝进行开壳，记录完全脱壳（贝壳与贝肉完整剥离，贝壳上无残留贝肉）的扇贝数，并按下式计算脱壳率。

1.3.3 拉曼光谱分析

取分离后的闭壳肌，并将界面闭壳肌沿纵轴切下，并分切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm小块，利用拉曼光谱分析仪进行分析，拉曼光谱分析仪分析参数：激发波长515.4 nm、狭缝宽度200 μm、功率129 mW、曝光时间60 s、扫描3 次、检测的波长范围400～4 000 cm－1。最后取3 次结果的平均值绘制拉曼光谱图，得到的数据经过Labspec 5.0软件处理后，利用Alix软件进行曲线拟合并计算出蛋白质二级结构的相对含量[11-12]。

1.3.4 扫描电子显微镜观察

取界面闭壳肌样品（2 mm×2 mm×0.5 mm），用体积分数为2.5%戊二醛溶液固定24 h，取出后用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3 次，每次10 min，然后分别用体积分数50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度洗脱，每次10 min，再用冷冻干燥机干燥。干燥后的样品进行离子渐射镀金，在场发射扫描电子显微镜下进行观察、拍照。

1.4 数据处理与分析

实验均设3 组平行，用Excel软件处理数据，计算出平均值和标准差，用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对扇贝脱壳率的影响

脱壳是扇贝加工生产中不可或缺的重要工序，脱壳率和脱壳效果影响扇贝加工生产效率和产品品质。扇贝在100 MPa压力下进行短时间处理，贝壳与贝肉无法实现完全剥离，由图1可见，当保压时间延长至240 s时，脱壳率提高到90%，当压力升高到300 MPa，瞬时就可以使脱壳率接近100%，但是，当压力升高到400 MPa时，虽然贝肉可以完整地从扇贝上剥离下来，但贝壳会在一定程度上产生破损，因此，采用较低压力保持较长时间或者300 MPa左右的超高压压力瞬时处理都可以达到完整脱壳的目的。根据脱壳率结果，确定后续实验压力为100～300 MPa。

图1 超高压处理对扇贝脱壳率的影响Fig. 1 Shelling efficiency of UHP-treated scallops as a function of pressure

超高压设备增压过程时间比较短，扇贝在处理过程中，压力升高至100、200 MPa和300 MPa的过程对试样影响比较小，主要作用集中在压力稳定后保持的过程中，因此，后续的实验未考虑增压过程对试样的影响。

2.2 超高压处理对扇贝界面闭壳肌结构的影响

实验所使用的扇贝闭壳肌厚度为20～30 mm，但是闭壳肌与贝壳的接触面只有上下两端，中间段闭壳肌并未与扇贝贝壳接触，在研究脱壳机理之前，针对接触面位置闭壳肌和非接触面位置闭壳肌在超高压处理时的结构变化情况进行了分析，结果发现，接触面位置的扇贝闭壳肌对超高压压力的敏感度要远大于非接触面的闭壳肌，因此，在研究扇贝脱壳机理时，与贝壳接触位置的闭壳肌才具有一定的研究意义。将贝壳与闭壳肌接触面以上2 mm厚度的闭壳肌段定义为界面闭壳肌，并以界面闭壳肌为研究对象，利用拉曼光谱和扫描电子显微镜等分析手段对施加不同超高压条件的扇贝界面闭壳肌进行测定，通过对蛋白质空间结构和微观结构进行分析，得出闭壳肌结构变化对闭壳肌纤维蛋白力学性能的影响。

2.2.1 不同压力对扇贝界面闭壳肌拉曼光谱的影响

由图2可知，界面闭壳肌的拉曼光谱图特征峰主要集中在两个波段，一段集中在500～1 800 cm－1，这个范围通常被认为是指纹图谱区，主要体现的是扇贝界面闭壳肌中氨基酸残基的微环境和蛋白质的空间构象；另外一个波段集中出现在2 800～3 050 cm－1，为—CH伸缩振动区[13-16]。经过不同压力保持2 min的处理，闭壳肌的各特征峰位置保持不变，但峰强度发生了比较明显的变化，特别是在压力为200 MPa和300 MPa时，相对于未处理组和100 MPa处理组，其峰型突然变得非常陡峭，且与未处理的扇贝界面闭壳肌相比，表征界面闭壳肌主链的酰胺III带（1 333 cm－1）和酰胺I带（1 657 cm－1）特征峰的强度明显增强[17-19]，这主要是由于在压力的作用下，蛋白质分子间的作用力发生了变化，比较低的压力可以促进氢键的形成，使蛋白质在酰胺III带和酰胺I带特征峰强度增大，但随着压力的增加，氢键的形成更加困难，并且还有部分氢键在压力的作用下被打开，所以随着压力的升高，峰强度逐渐减弱；在942 cm－1处的C＝C伸缩振动特征峰强度随着压力的升高而出现先升高后降低的趋势，但相比于未处理的扇贝界面闭壳肌，超高压处理组的特征峰强度明显增大，该位置属于α-螺旋结构的特征峰，这说明在刚刚产生压力的时候，压力促进了α-螺旋结构的形成而使其含量增大，但随着压力的增加，分子间作用力被破坏，氢键很难保持原有的结构而被打开，此时，α-螺旋结构的含量有所降低[20-24]。

图2 不同压力处理的扇贝界面闭壳肌拉曼光谱图Fig. 2 Raman spectra of scallop adductor muscle treated at different pressures

2.2.2 不同压力处理对扇贝界面闭壳肌蛋白质主链构象及二级结构的影响

在拉曼光谱中，1 600～1 700 cm－1是酰胺I带的特征谱带，在这一个区域内提供了蛋白质分子之间C＝O的伸缩振动、肽链内部的C—N伸缩振动、C—N以及N—H的面内弯曲振动等关于蛋白质二级结构的信息[25-26]，而二级结构的变化会对扇贝的脱壳产生比较重要的影响。拉曼光谱在酰胺I带区域的谱带信息能用于定量蛋白二级结构和反映主链构象，在超高压压力的作用下，多肽分子间氢键发生改变的难易程度会影响蛋白质分子构象，也会影响酰胺I带的拉曼光谱图谱信息[27]；因此，利用拉曼光谱图谱对蛋白质的二级结构进行分析，对研究蛋白质的构象和扇贝脱壳机理有非常重要的作用。

利用拉曼光谱分析仪自带的Labspec 5.0软件对所得到的光谱数据进行去除基线、扣除荧光背景等处理，以并不受蛋白质结构影响的苯丙氨酸环（1 004 cm－1）作为内标对数据进行归一化处理，处理后的数据利用Alix软件进行去卷积、二阶求导及曲线拟合，对拉曼光谱进行分峰处理，得到分峰和迭代拟合曲线如图3所示。

图3 不同超高压压力下扇贝界面闭壳肌蛋白质酰胺I带分峰和迭代拟合曲线Fig. 3 Protein amide I band peaks and iterative fitting curves of scallop adductor muscle treated at different pressures

通过计算图3中蛋白质α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲所对应的峰面积比例，得到贝壳界面位置闭壳肌蛋白质各二级结构的相对含量，结果如表1所示。随着压力的升高，α-螺旋结构相对含量降低、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构的相对含量均逐渐增大。与未处理组α-螺旋结构相对含量（74.69%）相比，100 MPa处理组α-螺旋结构的相对含量降低了8.64%，当压力升高至300 MPa时，α-螺旋结构的相对含量仅为52.61%，比未处理的扇贝界面闭壳肌减少了29.56%，说明在2 min的处理时间下，多肽链间的氢键稳定性受压力的影响比较大，在压力升高的过程中，稳定性逐渐变差。当压力为100 MPa时，β-折叠结构的相对含量为8.94%，与未处理组相比提高了96.92%，而当压力升高至300 MPa时，β-折叠结构的相对含量提高至21.45%，与未处理扇贝界面闭壳肌相比提高了3.72 倍，说明第n个氨基酸残基的酰基氮与多肽链C端方向的第n＋4个氨基酸残基的羰基碳之间形成的氢键在超高压实验条件下被破坏，同时相邻肽链主链的N—H和C＝O之间形成了有规律的氢键，使α-螺旋结构被伸展为β-折叠结构，因此，β-折叠结构的相对含量有所增加。与未处理组相比，100、300 MPa处理组的β-转角相对含量分别提高了6.34%和28.40%，β-转角结构是肽链第一个残基的C＝O与第4个残基的N—H氢键形成的一个紧密的环，因此β-转角结构的稳定性比较好，并且降低了多肽链方向的阻力，随着压力的升高，β-转角相对含量逐渐增大，说明更多的多肽链形成了稳定的环状结构，多肽链的稳定性得到提高。随处理压力的提高，扇贝界面闭壳肌蛋白质中的无规卷曲相对含量虽然有所增加，但增加的幅度比较小，当压力为300 MPa时，无规卷曲的相对含量最高（10.43%），与未处理组相比仅提高了14.87%。综上所述，压力的提高使扇贝界面闭壳肌蛋白质的二级结构发生了比较明显的变化，但变性程度并不高，因为无序松散肽链（无规卷曲）相对含量并没有发生较大的变化。

表1 超高压压力对扇贝界面闭壳肌蛋白质二级结构的影响Table 1 Effect of UHP on protein secondary structure in scallop adductor muscle

2.2.3 不同压力对扇贝界面闭壳肌蛋白质侧链结构的影响

2.2.3.1 超高压压力对酪氨酸残基的影响

在拉曼光谱图的830 cm－1和850 cm－1附近出现的费米共振双峰体现的是扇贝界面位置闭壳肌蛋白质侧链的氨基酸残基图谱，它反映了酪氨酸残基苯环的取代基振动状态，通常可以用850、830 cm－1处峰强度的比值（I850cm－1/I830cm－1）来反映酪氨酸残基的状态，当I850cm－1/I830cm－1≥1时，表示酪氨酸残基处于暴露状态，当比值小于1时则表示酪氨酸残基处于包埋状态[28]。

由图4可以看出，不同压力处理条件下的扇贝界面闭壳肌蛋白质酪氨酸残基对应的拉曼光谱图具有比较大的差别，在830 cm－1和850 cm－1处的费米共振双峰的强度在压力作用下变化比较明显，当压力为100 MPa时，830 cm－1和850 cm－1处的费米共振双峰强度明显增大，而当压力继续升高时，这两处的吸收峰强度又逐渐减弱，这说明在压力为100 MPa时，两处的振动强度最大，酪氨酸残基苯环的取代基振动也最为明显。未处理组和100、200、300 MPa处理组的I850cm－1/I830cm－1分别为1.032、1.080、1.080、1.071，说明所有组的酪氨酸残基均处于暴露状态，且经超高压处理后暴露的程度要比未处理时的更明显，但300 MPa处理组的I850cm－1/I830cm－1比100、200 MPa处理组小，说明从200 MPa增加到300 MPa的过程中，酪氨酸残基暴露程度降低。因此在压力不超过200 MPa时，扇贝界面闭壳肌的蛋白质结构发生了转变，使更多的酪氨酸残基在多肽链的表面暴露出来，闭壳肌样品的I850cm－1/I830cm－1增大；当压力超过200 MPa时，酪氨酸残基苯环上—OH的氧原子由氢键的供体逐渐转变为受体，I850 cm－1/I830 cm－1减小。

图4 扇贝界面闭壳肌酪氨酸、色氨酸残基拉曼光谱图Fig. 4 Raman spectra of tyrosine and tryptophan residues in scallop adductor muscle protein

2.2.3.2 超高压压力对色氨酸残基的影响

在拉曼光谱中，755 cm－1附近的区域通常表征的是蛋白质色氨酸所处的微环境，若该处所对应的峰强度下降，则表示色氨酸残基趋于暴露，反之则表示色氨酸残基趋于包埋。由图4可以看出，压力升高会使色氨酸残基拉曼图谱所对应的峰强度出现先增大后减小的趋势，当压力为200 MPa时，755 cm－1处所对应的峰强度最大，而后随着实验压力的增大，峰强度逐渐减小，说明压力在0～200 MPa增加时，色氨酸残基在疏水性环境中包埋程度增加，当压力超过200 MPa以后，色氨酸残基逐渐由包埋状态向极性环境中暴露。

2.2.4 不同压力对蛋白质C—H键振动作用的影响

拉曼光谱图2 900 cm－1附近的谱带表征蛋白质芳香族氨基酸、蛋白质和多肽中C—H的伸缩振动信息。由图5可知，在不同压力条件下得到的扇贝界面闭壳肌蛋白质的拉曼光谱图在2 945 cm－1处均出现了一个非常强烈的尖峰，该特征峰表征的是—CH2—的非对称伸缩振动或者—CH3的对称伸缩振动，经过分析还发现在2 876 cm－1附近出现了一个次峰，这个次峰则表征—CH2—的非对称伸缩振动。关于拉曼光谱C—H键振动研究的结果表明，芳香族氨基酸在蛋白质二级结构中的α-螺旋被伸展时增强了芳香氨基酸的C—H间的疏水作用，增加了羟基在极性的微环境中的暴露程度，引起表征C—H伸缩振动所对应的拉曼光谱特征峰的强度增大[29]。

由图5可知，在超高压压力的作用下，相比于未处理的扇贝界面闭壳肌，芳香族氨基酸在2 876 cm－1和2 945 cm－1处的峰强度明显增加，说明在不同压力的超高压作用下，蛋白质均发生了不同程度的变性，随着压力的增加，这两处特征峰强度出现先增加后降低的趋势，当实验压力为300 MPa时，峰强度减弱的程度较小，说明在超高压压力的作用下，α-螺旋结构的伸展程度比较大，使较多的芳香族氨基酸侧链暴露于极性环境中，从而形成了较强的疏水作用，引起了蛋白质二级结构的变化，导致蛋白质变性，从而失去了原有的功能特性。

图5 扇贝界面闭壳肌蛋白质芳香族氨基酸拉曼光谱图Fig. 5 Raman spectra of aromatic amino acid residues in scallop adductor muscle protein

2.2.5 不同压力对扇贝界面位置闭壳肌蛋白质二硫键构型的影响

二硫键在稳定某些蛋白的三维结构上起着重要的作用。在拉曼光谱中，二硫键的振动体现出不同的特征，一般来说，二硫键的特征谱带通常出现在500～550 cm－1附近，且在拉曼峰中可以体现出分子内部或分子间巯基与二硫键之间的转化关系。

由图6可以看出，与未处理组相比，扇贝界面闭壳肌蛋白质中二硫键所对应的拉曼光谱特征峰发生了比较明显的偏移。当二硫键的特征峰在515～525 cm－1之间时，表征二硫键的g-g-t构象，当二硫键的特征峰在535～545 cm－1之间时，表征二硫键的t-g-t构象。因此，当压力为200 MPa时，蛋白质二硫键的构象发生了转变，由原本的g-g-t构象变成了t-g-t构象；当压力为300 MPa时，二硫键的拉曼特征峰又向低频方向移动了8 cm－1，位于527 cm－1附近区域，这说明二硫键又出现重新形成g-g-t构象的趋势，综上所述，在保压时间为2 min的条件下，200 MPa的压力能够引起二硫键构象的转变，但当压力超过200 MPa时，这种转变又产生了可逆的变化，蛋白质二硫键构象被还原。

图6 扇贝界面闭壳肌蛋白质二硫键拉曼光谱图Fig. 6 Raman spectra of disulfide bond in scallop adductor muscle protein

2.3 超高压处理对扇贝界面位置闭壳肌微观结构的影响

由图7可以看出，未经过处理的扇贝界面闭壳肌呈现出比较连续完整、均匀分散的纤维，且纤维之间基本保持互相平行分布，形态具有一定的规律性。超高压处理后，闭壳肌纤维发生了较明显的变化，当压力为100 MPa时，闭壳肌纤维变得粗细不均，并在纤维表面出现了少量的松散结构，这说明在超高压压力作用下，蛋白质原有的规律性结构被破坏，这与蛋白质多肽链间氢键的变化和蛋白质变性有很大的关系；当压力为200 MPa和300 MPa时，非纤维性蛋白结构的数量明显增多，这可能是由于蛋白质中的α-螺旋结构间的氢键在实验压力的作用下遭到破坏，使得蛋白质中的氨基酸侧链暴露在多肽链的表面。

图7 不同超高压压力下扇贝界面闭壳肌扫描电子显微镜图Fig. 7 SEM images of scallop adductor muscle treated at different pressures

3 结 论

本实验针对超高压处理对扇贝界面闭壳肌蛋白质主链二级结构、蛋白质侧链结构及二硫键的构型影响进行了研究，借助拉曼光谱仪和扫描电子显微镜等仪器对蛋白质结构及性能的变化进行了分析。通过分析结果可知，蛋白质的主链结构对实验压力比较敏感，随处理压力（100～300 MPa）增加，蛋白质二级结构中的α-螺旋相对含量降低，β-折叠、β-转角和无规卷曲相对含量均升高；酪氨酸残基均处于暴露状态，但在300 MP处理组的暴露程度相对较低；色氨酸残基的包埋程度先增加后降低，在200 MPa时的包埋程度最高。与未处理组相比，200 MPa的压力能引起二硫键构象的改变。综上所述，在超高压压力的作用下，蛋白质主链和侧链的结构及空间构象都有了比较明显的变化，这些结构的变化和状态的转变对闭壳肌的力学特性、与贝壳之间的结合强度及蛋白质的水溶性都有非常显著的影响，这些力学及生物特性的变化也会影响扇贝超高压脱壳的效果。