李慧星，周永康，方佩琦，郑立霖，哈海洋，许 彬,*

（1.南阳理工学院生物与化学工程学院，河南 南阳 473004；2.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004）

山药（Dioscorea oppositifoliaL.）是传统的药食同源食物，是《中华本草》收载的草药[1]，山药提取物具有抗氧化活性，可用于清除自由基[2-5]。山药中富含淀粉、纤维素等物质[1]，可以用作食药用真菌发酵底物。杨海龙等[6]以山药作为碳源通过液态发酵生产灵芝，当山药用量为3%（质量分数）时，灵芝菌体生物量可达2.05 g/100 mL。于汇等[7]以山药等中药材和粮食原料进行搭配，经猴头菌发酵后制成饮料，产品的药用作用明显。张志才等[8]将蛹虫草接种于山药和其他粮食成分组成的基质上进行固态发酵，生产功能性食品。

蛹虫草又名北冬虫夏草，是一种常用的食药用真菌，能代谢产生核苷类、多糖类、甾醇、氨基酸等生物活性物质[9]，且虫草素含量和抗氧化活性高于冬虫夏草[10-11]。

本研究基于庄毅等[12]提出的“双向发酵”概念，以山药为基质，以蛹虫草为发酵真菌进行固态发酵。山药可以为蛹虫草菌丝生长代谢提供营养物质，蛹虫草的酶系能够改变山药成分组成和空间结构，最终使得发酵后的山药可能在某一活性上获得增效，即发酵具有“双向性”，发酵所得的山药-蛹虫草-代谢产物混合物称为菌质。本实验通过测定菌质和山药的超氧阴离子自由基（O2－•）清除率、2,2-二苯基-1-苦基肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率和羟自由基（•OH）清除率来评价两者的抗氧化活性差异，并通过抗氧化活性成分含量的测定、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪分析研究菌质和山药存在抗氧化活性差异的原因，为将山药-蛹虫草菌质开发成相关抗氧化食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山药 南阳市万德隆超市；蛹虫草14013 中国工业微生物菌种保藏管理中心；葡萄糖、水杨酸、无水乙醇、磷酸二氢钾、硫酸镁、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、连苯三酚、氯仿（均为分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；VB1北京酷来搏科技有限公司；琼脂粉北京奥博星生物技术有限责任公司；DPPH（分析纯）、虫草素标准品（色谱纯）、薯蓣皂苷标准品（色谱纯）合肥博美生物科技有限责任公司；乙腈、甲酸（色谱纯） 上海麦克林生化科技有限公司；溴化钾（光谱纯） 天津中世沃克科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C精密酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；LCD250N超声波细胞破碎机上海冠森生物科技有限公司；FreeZone®TriadTM2.5L真空冷冻干燥机 美国LABCONCO有限公司；LRHS-300-II恒温恒湿培养箱、HH.S11-4-S控温水浴锅上海跃进医疗器械有限公司；LDZX-30FB立式灭菌器上海申安医疗器械有限公司；LC1260 HPLC仪（配有二极管阵列检测器） 美国安捷伦公司；180EII超声波清洗器 宁波海曙科生超声设备有限公司；RE-52C旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；Spectrum TWO FTIR仪美国Perkin-Elmer公司；SU8000 SEM 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 山药-蛹虫草菌质的发酵

山药-蛹虫草菌质的发酵方法参考文献[13]。山药洗净、切碎，得到边长2～3 mm左右的正方体颗粒、自然晾干至水分质量分数10%左右。实验分为接种组和空白对照组，每组3 个平行培养瓶，在每个培养瓶中分装山药33.7 g、蒸馏水37.2 mL，拌匀，浸润2 h。将装有山药的培养瓶置于121 ℃下灭菌30 min。蛹虫草菌种在马铃薯琼脂培养基固体平板上于温度25 ℃、相对湿度75%条件下培养10 d后，从平板上刮取边长0.8 cm的正方形蛹虫草菌苔接种于装有山药的培养瓶中，每个培养瓶接种13 个边长0.8 cm的正方形蛹虫草菌苔。接种后在温度25 ℃、相对湿度75%的条件下发酵生产山药-蛹虫草菌质。实验以不接种蛹虫草菌种的山药作为空白对照。

1.3.2 提取物的制备

提取物的制备参考文献[14]。1）蛹虫草菌丝提取物的制备：蛹虫草菌种在马铃薯琼脂培养基固体平板培养10 d后，刮取边长约0.8 cm的正方形菌苔10 块，用研钵将菌苔研碎，用50 mL乙醇将研碎菌苔洗至圆底烧瓶中，在70 ℃水浴中回流提取1 h，滤去固体后将乙醇蒸干，再加入色谱级乙腈溶解，定容至5.0 mL。采用0.22 μm滤膜过滤溶液后备用。2）菌质提取物的制备：山药-蛹虫草菌质冷冻干燥后称取1.0 g，加入50 mL乙醇超声处理（250 W、25 min），然后在70 ℃水浴中回流提取1 h，滤去固体后将乙醇提取液浓缩干燥，加入色谱级乙腈溶解，定容至10 mL。采用0.22 μm滤膜过滤溶液后备用。

1.3.3 自由基清除率的测定

以自由基清除率表征菌质的抗氧化活性，其中•OH清除率的测定参考文献[15]，DPPH自由基清除率的测定参考文献[16]，O2－•清除率的测定参考文献[17]。

1.3.4 抗氧化活性成分含量的测定

总酚含量的测定参考文献[18]，总黄酮含量的测定参考文献[19]，总皂苷含量的测定参考文献[20]，总多糖含量的测定参考文献[21]。

1.3.5 HPLC指纹图谱分析

色谱条件：InfinityLab Poroahell C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，4 μm）；检测波长260 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL；流动相A为体积分数0.1%甲酸-水溶液，流动相B为乙腈；流速0.8 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

表1 HPLC梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

1.3.6 SEM观察

样品在60 ℃下干燥至恒质量，粉碎过100 目筛后以SEM观察分析菌质的表面形态和结构。

1.3.7 FTIR分析

样品在60 ℃下干燥至恒质量，粉碎过100 目筛后采用溴化钾压片法制备试样。FTIR在波数4 000～450 cm－1范围内分析，扫描16 次，分辨率4 cm－1。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0对数据进行处理、绘图和差异显著性分析，采用最小显著极差法（least significant ranges，LSR）进行多重比较，P＜0.05说明差异显著。实验结果除有特殊说明外，均为3 次实验平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 菌质的抗氧化活性

由图1可知，山药-蛹虫草双向发酵过程中，菌质对各种自由基的清除率随发酵时间延长而提高，在发酵前2 d，菌质自由基清除率变化不显著（P＞0.05），而在发酵2～8 d，菌质自由基清除率有明显提高，在发酵时间达到8 d以后，菌质自由基清除率总体来说变化不显著（P＞0.05）。在发酵前2 d，菌丝刚萌发，在基质中局部分布（图2A），因此菌质整体的抗氧化活性未发生明显改变。当发酵8 d后，菌丝已经基本布满基质（图2B），发酵接近终点时菌质的抗氧化活性基本稳定，相对于发酵初期有显著提高（P＜0.05），说明菌质的抗氧化活性与菌丝的生长存在一定相关性。

图1 菌质抗氧化活性随培养时间的变化Fig. 1 Change in antioxidant activity of Chinese yam during fermentation

图2 山药-蛹虫草菌质表观情况Fig. 2 Apparent situation of Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

发酵结束后山药和菌质的抗氧化活性如表2所示。菌质的各项自由基清除率均显著高于山药的自由基清除率（P＜0.05），说明山药经蛹虫草发酵后得到的菌质其抗氧化活性明显提高。因此，可以认为山药-蛹虫草双向发酵在抗氧化活性方面具有增效性。

表2 山药和菌质的自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rates of Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

2.2 山药和菌质的抗氧化活性成分含量分析结果

除总多糖外，菌质中各种抗氧化活性成分含量均显著高于山药（P＜0.05）（表3），这与张志才等[8]的研究结果一致。山药-蛹虫草双向发酵后菌质总多糖含量降低，这是由于蛹虫草在发酵过程中分解利用了山药中总多糖。山药-蛹虫草双向发酵后，菌质中总酚、总黄酮和总皂苷含量显著提高（P＜0.05），因此菌质的抗氧化活性高于山药的抗氧化活性。

表3 山药和菌质的抗氧化活性成分含量Table 3 Contents of antioxidants in Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

2.3 HPLC指纹图谱分析结果

山药-蛹虫草菌质、蛹虫草菌丝提取物的HPLC指纹图谱如图3所示。虫草素标准品和薯蓣皂苷标准品的HPLC图如图4、5所示。对图3～5中的特征峰进行统一编号，并将编号标注于各图中。

图3 菌质、山药和蛹虫草菌丝提取物HPLC指纹图谱Fig. 3 HPLC fingerprints of the extracts of Chinese yam fermented with Cordyceps militaris, Chinese yam and Cordyceps militaris mycelium

图4 虫草素标准品的HPLC图Fig. 4 HPLC chromatogram of cordycepin reference substance

由图3可知，17号峰在各种样品的提取物中均存在，该峰分离度较好且稳定，因此选择该峰为参照峰。以其峰面积和保留时间为基准，分别计算各提取物中其他成分的峰面积和保留时间与17号峰面积和保留时间的比值，记为相对峰面积和相对保留时间[22-23]，如表4所示。

表4 HPLC指纹图谱特征峰的相对保留时间和相对峰面积Table 4 Relative retention times and relative peak areas of characteristic peaks in HPLC fingerprints

由图3和表4可知，4、7、11、15号峰在山药和蛹虫草菌丝中均未出现，参考潘扬等[24]对HPLC图谱中新物质的判定方法，可以认为这4 种物质是山药-蛹虫草双向发酵后生成的新物质。3、12、23、24号峰在菌质和蛹虫草菌丝中出现，而在山药中未出现，表明这4 种成分是蛹虫草发酵后生成的物质，进一步与图4对比分析，3号峰对应的物质为虫草素。5、8、9、13、14、16号峰在菌质、山药中均有出现，但菌质中这6 种物质的相对峰面积相明显减小，9、13号峰相对峰面积减小尤为明显，说明这几种成分被蛹虫草代谢分解或转化为其他成分。图3山药中的1号峰和10号峰在菌质中没有检测到，可能是由于蛹虫草的代谢作用改变了这两种物质的结构。17～22号峰（保留时间为74.3～87.5 min）在菌质、山药、蛹虫草菌丝中均有出现，与图5对比可知，保留时间在该范围内的物质应为五环三萜类化合物。由于蛹虫草菌丝是以马铃薯培养基培养的，而该培养基的主要成分为马铃薯提取液。马铃薯中含有三糖五环三萜类化合物，与薯蓣皂苷具有相同的骨架结构[25-26]，因此在HPLC指纹图谱中与薯蓣皂苷的保留时间接近，且相对峰面积也接近。在从马铃薯琼脂培养基斜面上分离蛹虫草菌丝时有培养基残留，因此图3各物质提取物中都出现了五环三萜类化合物的特征峰。由以上分析可知，菌质和山药的成分存在较大差异，菌质因蛹虫草的代谢作用产生了山药中原本不存在的物质，并改变了山药中原有成分的含量，这可能是菌质抗氧化活性高于山药的另一个原因。

图5 薯蓣皂苷标准品的HPLC图Fig. 5 HPLC chromatogram of dioscin reference substance

2.4 山药和菌质的SEM图观察结果

由图6A可知，山药表面有褶皱，形态完整、连续。由图6B可知，菌质的形态和结构发生变化，山药基质的表面附着有蛹虫草菌丝体，表面褶皱减少、形态不再完整，有碎片分布。说明山药的完整结构因蛹虫草菌丝的生长和分解作用而被破坏，活性物质更加容易提取，这也是菌质抗氧化活性提高的原因之一。

图6 山药（A）和菌质（B）的SEM图Fig. 6 SEM images of Chinese yam (A) and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris (B)

2.5 山药和菌质的FTIR分析结果

山药和菌质的FTIR结果如图7所示。山药和菌质的FTIR图在2 000～1 845 cm－1和710～576 cm－1范围内有差异。苯环上有取代基的物质在2 000～1 660 cm－1内存在低强度的特征吸收峰，环醚在该区域也存在低强度的多个吸收峰[27]，结合多酚类化合物的分子结构以及刘琪[28]关于橡子果仁多酚研究的红外光谱图，推断图7中2 000～1 845 cm－1区域内的吸收峰是由多酚中的共轭双键（C＝C）和邻取代芳烃（C－H）结构的伸缩振动产生的。菌质相比山药在2 000～1 845 cm－1区域的吸收峰更明显。结合总酚测定结果，推断这种差异可能是由于蛹虫草发酵山药后产生了更多的多酚类物质。1 650～500 cm－1范围内的吸收峰属于山药的特征吸收峰[29-30]，860～500 cm－1范围内的吸收峰主要是由多糖、纤维素、皂苷中糖苷键振动产生的[30-32]。比较山药和菌质的FTIR图发现，710～576 cm－1范围内菌质的吸收峰数量减少而吸收强度略有增加，这可能是由于山药中的多糖、纤维素等作为碳源被菌丝所代谢，而一部分降解产物被菌丝用于合成了更多的皂苷。根据山药和菌质的FTIR图变化可以推断，蛹虫草能够分解山药中的组分供自身生长，而产生的代谢物对菌质的抗氧化活性具有贡献作用，即山药-蛹虫草发酵体系具有双向性，并对山药抗氧化活性具有增效作用。

图7 山药和菌质的FTIR图Fig. 7 FTIR spectra of Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

3 结 论

山药经蛹虫草双向发酵后，菌质的各项自由基清除率明显高于山药，说明菌质的抗氧化活性优于山药，山药-蛹虫草双向发酵体系在抗氧化活性方面具有增效性。菌质成分的种类和含量变化、菌质结构变化是产生抗氧化活性增效性的主要原因。由活性成分含量分析可知，山药-蛹虫草菌质中总酚、总黄酮和总皂苷含量明显高于山药；由HPLC指纹图谱分析结果可知，山药-蛹虫草菌质提取物的HPLC指纹图谱与山药提取物图谱有明显不同，不仅产生了一些山药中不存在的新成分，而且山药中原有成分的含量也发生明显变化。由SEM分析结果可知，蛹虫草对山药的空间结构有分解破坏作用，利于蛹虫草利用山药基质生成活性物质。由FTIR分析结果可知，蛹虫草代谢了山药中的多糖、纤维素等碳源物质，生成了多酚类物质等。结果表明菌质成分的种类和含量变化、菌质结构变化是产生抗氧化活性增效性的主要原因。