张世微 徐章 张志海 何焕然

(1湖北职业技术学院，湖北 孝感 432000；2孝感市中心医院；3汉川市血防办公室；4孝感市孝南区血防办公室)

铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌，是肺炎的常见病原菌，尤其是在医院获得性肺炎中极为常见〔1〕。铜绿假单胞菌肺部感染后极易诱发全身性炎症反应，甚至有可能发展成为多器官功能障碍综合征，严重者会导致死亡〔2〕。LncRNA MALAT1是最早鉴定出与人类疾病相关的LncRNA之一〔3〕。研究表明。LncRNA MALAT1与人类多种肺部疾病的发生和发展密切相关，有研究报道LncRNA MALAT1参与了脂多糖诱导的急性肺损伤〔4〕，同时LncRNA MALAT1还可以作为预测非小细胞肺癌患者预后的生物标志物〔5〕。核因子(NF)-κB是一种广泛存在的多效应转录因子，参与了大鼠铜绿假单胞菌肺炎的发生和发展〔6〕。LncRNA MALAT1作为NF-κB的前体调控因子〔7〕，有可能参与了铜绿假单胞菌导致肺炎的发展过程。本研究通过构建铜绿假单胞菌大鼠肺炎模型，探讨LncRNA MALAT1在铜绿假单胞菌大鼠肺炎中作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与菌种 清洁级SD大鼠30只，雌雄各15只，周龄8～12 w，体重180～230 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(实验动物合格证编号：12910371116)。铜绿假单胞菌标准株(ACTT27853)购于北纳创联生物技术有限公司。

1.2实验试剂及主要仪器 SD大鼠C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α定量酶联免疫试剂盒购于上海沪震实业有限公司；SD大鼠超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购于上海研启生物科技有限公司；TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司；PCR Master Mix试剂盒和qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；SD大鼠NF-κB免疫组化试剂盒购于上海雅吉生物科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白质浓度测定试剂盒购于福州奥研实验器材有限责任公司。大鼠固定台；XFA6130全自动动物血液细胞分析仪；光学显微镜；分光光度仪；酶标仪。

1.3动物模型构建及样本收集 采用随机数字法将实验动物分为对照组、模型组和敲降LncRNA MALAT1模型组，每组10只。敲降LncRNA MALAT1模型组使用10%水合氯醛(0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后将含有sh-MALATA1-RNA的PFU聚合酶经鼻吸入大鼠肺内，继续常规饲养72 h后用于后续实验。在模型构建前1 d将铜绿假单胞菌标准株接种于MH琼脂平板上，置于恒温培养中培养24 h，肉眼可见绿色铜绿假单胞菌生长后进行灭菌，配制成2个麦氏单位浓度(6×1011cfu/L)的菌液待用。使用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠完全麻醉后将其固定在固定台上，使用止血钳拉出大鼠舌头后固定于外部。使用注射器抽取0.4 ml菌液并插入大鼠气管内，注菌完成后立即竖立大鼠并固定，左右摇晃固定台1 min。对照组采用同样的方法注入0.4 ml灭菌生理盐水。

接种24 h后处死各组大鼠，使用EP管从眼窝处收集各组大鼠1.5 ml血液。分离大鼠气管后使用1.0 ml生理盐水进行灌洗并收集灌洗液。将大鼠血液和支气管肺泡灌洗液在4℃条件下3 000 r/min离心5 min，收集上清液后冻存于-80℃冰箱中待用。在无菌条件下剖取各组大鼠肺组织，冻存于-20℃冰箱中待用。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠血清CRP水平 取0.5 ml大鼠血液，在4℃条件下3 000 r/min离心5 min后收集上清，使用大鼠CRP定量酶联免疫试剂盒，参照试剂盒说明书检测各组大鼠血液中CRP水平。

1.5ELISA测定大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α水平 取各组大鼠肺组织(6 mm×6 mm×6 mm)在研磨器中研磨成组织匀浆，在4℃条件下12 000 r/min离心15 min，并收集组织匀浆上清液。使用大鼠IL-8和TNF-α定量免疫酶联试剂盒，根据试剂盒说明书检测大鼠肺组织匀浆和支气管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平。

1.6RT-qPCR检测大鼠肺组织内LncRNA MALAT1表达 取各组大鼠肺组织后研磨成组织匀浆。使用TRIzol试剂提取组织中的总RNA，使用PCR Master Mix试剂盒将RNA逆转录为cDNA，使用qPCR SYBR Green Master Mix进行实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt法进行计算。LncRNA MALAT1上游引物序列：5′-GCGAGCAGGCATTGTGGAGAG-3′；下游引物序列：5′-GCCGACCTCAAGAATGTTACCG-3′。GAPDH上游引物序列：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；下游引物序列：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。

1.7大鼠肺组织中SOD和MDA水平检测 取各组大鼠肺组织后研磨成组织匀浆，在4℃条件下12 000 r/min离心15 min，并收集组织匀浆上清液。使用大鼠SOD和丙二醛检测试剂盒，使用分光光度仪参照试剂盒说明书检测大鼠肺组织中SOD和MDA水平。

1.8大鼠肺组织和血液中蛋白质浓度测定 收集各组大鼠肺组织和血液。处理后使用酶标仪测定样本在562 nm处的吸光光度值，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定各组大鼠肺组织和血液中的蛋白质浓度。

1.9免疫组化染色检测各组大鼠肺组织中NF-κB的活性 收集大鼠肺组织，4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋。切片后进行常规脱蜡入水，参照试剂盒说明书使用链霉亲和素-生物素复合物法碱性免疫组化染色。

1.10统计学处理 使用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1SD大鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的构建 模型组接种铜绿假单胞菌24 h后临床表现为呼吸急促，双侧胸廓呼吸幅度增加，懒动，精神状态和食欲欠佳，蜷缩与鼠笼角落，对周围刺激反应较差，体毛粗糙且无光泽。对照组大鼠接种灭菌生理盐水前后无明显变化。接种前两组血液中WBC、NEUT、NEUTr%和CRP水平无明显差异(t=0.001、0.000、0.500、3.0.252,P>0.05)，接种后24 h模型组均明显升高(t=27.893、18.434、12.926、30.929,P<0.05)，对照组接种灭菌生理盐水24 h后血液中各指标无明显变化(t=0.707、0.877、0.097、0.485,P>0.05)，见表1。

表1 两组接种前后血液中各指标变化

2.2体内LncRNA MALAT1和炎症因子表达水平 RT-qPCR检测结果显示，模型组肺组织中LncRNA MALAT1水平(1.66±0.02)明显高于对照组(0.97±0.01，P<0.05)。ELISA检测结果显示，相较于对照组，模型组肺组织内IL-8和TNF-α水平明显升高(t=60.976、20.551,P<0.05)，且模型组支气管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平也明显升高(t=23.494、22.533,P<0.05)，敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平相较于模型组明显降低(t=43.244、16.033,P<0.05)，支气管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平也明显降低(t=7.365、14.397,P<0.05)，见表2。

表2 各组肺组织和支气管肺泡灌洗中炎症因子表达水平

2.3敲降LncRNA MALAT1可减轻铜绿假单胞菌引起的大鼠肺损伤 RT-qPCR检测结果显示，敲降LncRNA MALAT1后大鼠肺组织内LncRNA MALAT1表达水平(0.85±0.01)显著低于对照组与模型组(1.02±0.02、1.53±0.02，P<0.05)。相较于对照组，模型组肺组织和血清中蛋白质浓度均显著增加(t=9.351、3.436,P<0.05)，肺组织中SOD水平明显降低(t=13.751,P<0.05)，MDA水平明显升高(t=7.894,P<0.05)。

敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺组织和血清中蛋白质浓度相较于模型组明显降低(t=5.543、2.614,P<0.05)，且肺组织中SOD水平明显升高(t=12.374,P<0.05)，MDA水平明显降低(t=5.031,P<0.05)，见表3。

表3 各组肺损伤情况

2.4敲降LncRNA MALATA1对小鼠NF-κB活性的影响 免疫组化结果显示，模型组肺组织中细胞质和细胞核内较对照组(1.09±0.78)均有明显NF-κB着色(P<0.05)，敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺组织细胞质和细胞核NF-κB着色(15.13±2.13)相较于模型组(24.27±3.46)明显减少(P<0.05)。

3 讨 论

铜绿假单胞菌广泛分布于自然界的湿润环境中，也常定植于人体的呼吸道中。由于铜绿假单胞菌表面有抗吞噬和渗透作用的生物膜包覆〔8〕，且还具有多重耐药性〔9〕，因此铜绿假单胞菌导致的肺炎在治疗过程中存在诸多困难。随着铜绿假单胞菌感染的日益增多，其发病机制、病理改变和预防治疗成为了研究重点。

NF-κB信号通路参与了多种病原菌导致的肺炎〔10,11〕。本研究结果提示铜绿假单胞菌感染导致了大鼠肺组织中NF-κB信号通路的激活。研究显示，NF-κB信号通路的激活能调控一系列参与肺部炎症的炎症因子表达〔12〕，如IL-8和TNF-α。TNF-α作为一种重要的炎性介质，介导创伤后炎症反应，引起多器官组织损伤，同时还可刺激其他炎症因子表达，如IL-6和IL-8等。IL-8能促进溶酶体酶的释放，导致局部血管舒张、通透性增加，进而引起炎症反应。本研究结果显示，接种铜绿假单胞菌的模型大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平均明显增加。

LncRNA MALAT1参与了人体多种疾病的发生和发展，但在炎症调节中的机制较为复杂。Gu等〔7〕研究显示敲降LncRNA MALAT1可通过抑制NF-κB信号通路的活性减轻肺支原体诱导的肺部损伤。Cao等〔13〕研究显示，敲降LncRNA MALAT1减轻了小鼠脑缺血后的炎症反应，且过表达LncRNA MALAT1加剧了脑缺血后的炎症反应。然而Sun等〔14〕研究显示LncRNA MALAT1可保护脂多糖诱导的心肌细胞损伤，Cermer等〔15〕研究也表明LncRNA MALAT1抑制了血管内皮细胞的炎症反应，延缓了小鼠动脉粥样硬化病变的形成。LncRNA MALAT1在不同研究中不一致的作用可能是因为其在不同疾病中调控机制的差异所导致。本研究结果提示敲降LncRNA MALAT1可显著抑制铜绿假单胞菌肺炎大鼠的炎症反应并减轻因其导致的肺损伤，其机制可能与抑制NF-κB活性有关。

总之，铜绿假单胞菌感染上调了LncRNA MALAT1在大鼠肺组织中的表达，促进了NF-κB信号通路的激活。敲降LncRNA MALAT1后抑制了铜绿假单胞菌介导的大鼠肺部炎症反应并减轻了大鼠肺损伤，其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路活性实现的。