高秋珍 朱凤莲 张建新

(1许昌学院医学院，河南 许昌 461000；2新乡医学院第一临床医院)

急性肺损伤(ALI)是一种临床常见且病死率高的危重病症，是由直接或间接原因造成肺上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，肺毛细血管通透性增强，导致急性缺氧性呼吸衰竭，肺内抗炎与促炎因子比例失调〔1〕。其临床症状为发热、咳嗽、痰中带血，部分患者伴有呼吸困难或胸痛，ALI发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征。该疾病临床治疗困难，尚无标准化的治疗方法，现有的临床治疗方案尚不能取得令人满意的效果。ALI发病机制复杂，炎症反应在ALI发生发展的过程中起着重要作用〔2〕。因此，探寻新的有效可行的治疗手段成为科研工作者和临床医生面临的重大挑战。间充质干细胞(MSCs)是来源于中胚层和神经外胚层的前体细胞，具有自我更新和免疫调节作用〔3〕。该细胞最早发现于骨髓，后来在脐带血、胚胎、脂肪、肝脏、牙周等细胞中均有发现，几乎涵盖了人体的所有器官与组织，具有取材方便、容易分离培养增殖的特点，因而在创伤修复、免疫治疗及组织功能重建等领域应用前景极为广阔〔4〕。既往研究〔5〕实验结果表明MSCs对众多免疫细胞具有调节作用，它通过分泌趋化因子和细胞因子发挥作用。有研究表明，MSCs对炎症性疾病的治疗起着重要作用〔6〕，可减轻ALI患者肺部炎症并增强肺泡液体清除能力，对肺部疾病有治疗作用，MSCs已成为ALI的一种有前景的治疗方法。但目前关于应用人胎盘间充质干细胞(hPMSCs)治疗ALI的研究较少，因此，本实验通过研究hPMSCs对ALI患者的免疫调节作用，为hPMSCs应用于治疗ALI提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料 人胎盘组织取自新乡医学院第一临床医院产科临床足月剖宫产胎盘，产妇及家属均知情同意并签署知情同意书。本项研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器 胎牛血清(FBS，郑州九龙生物制品有限公司)；HBSS、DEEM和磷酸盐缓冲液(PBS,Gibco公司)；无钙镁磷酸盐缓冲液(PBS-CMF)；DNA酶Ⅰ(Roche公司)；A型胶原酶(北京盛科博源生物科技有限公司)；CD14-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD73-PE、CD105-PE鼠抗人单克隆抗体 IgG2a-FITC、IgG1-PE、CD8-PE、CD4-FITC及仪器流式细胞仪(BD公司产品)，白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海纪宁实业有限公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT，北京广源恒信科技发展有限公司)，胰蛋白酶和丝裂霉素C〔今品化学技术(上海)有限公司〕，倒置显微镜(Olympus公司)，电子天平(PB303-E型，梅德勒公司)，全自动高压锅，CO2培养箱，移液枪，大中小枪头，10 cm细胞培养皿，96孔板细胞培养皿，24孔板细胞培养皿。

1.3实验方法

1.3.1hPMSCs的分离与培养 将获取的胎盘无菌转移至细胞培养实验室内，用PBS漂洗3～4次后，将组织剪成0.5 cm厚的组织，然后用眼科剪将组织块剪成1 mm3的碎块，用PBS缓冲液洗涤3～4次，加入1 μg/ml DNA酶Ⅰ、0.1%A型胶原酶，在37℃恒温水浴锅中消化2 h。收集上清液，用100目细胞筛网筛除残留的大块组织，540 r/min离心5 s，收集上清液。加入100 ml/L的培养基悬重沉淀，接种于细胞培养皿中，置于5%CO2培养箱中37℃恒温培养。48 h换液，换液时用PBS多洗几次，并于第2天开始密切关注细胞生长，待细胞生长密度为85%～90%时进行传代培养，取3代hPMSCs细胞用于实验。

1.3.2hPMSCs特异性抗原鉴定 选取第3代处于对数生长期的hPMSCs细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化5 min后将细胞漂洗3次，接着用300目滤膜过滤。调整细胞数至1×107/ml并分装，每支流式细胞管加入0.1 ml细胞，然后加入CD45、CD14、CD90、CD34、CD105、CD73及HLA-DR-FITC等流式抗体，静置15 min后PBS重悬，加入PBS制成细胞悬液，最后进行流式细胞仪检测。

1.3.3hPMSCs与ALI患者外周血单个核细胞(PBMNCs)共培养 将hPMSCs置于37℃恒温水浴锅中，加25 mg/L丝裂霉素C预处理30 min。调整细胞浓度，将hPMSCs以1×105个/孔接种于24孔板。抽取ALI患者晨起空腹静脉血，采用Ficoll密度梯度离心法分离，得到PBMNCs。用RPMI1640培养液将其洗涤3次后，将PBMNCs以1×106个/孔接种到上述24孔板中，并加入10 μg/ml植物凝集素(PHA)，分为4组：PBMNCs组，PBMNCs+PHA组，hPMSCs+PBMNCs组，hPMSCs+PBMNCs+PHA组，每组3个重复样本；置于培养箱(37℃，5%CO2)中培养。

1.3.4MTT法检测hPMSCs+PBMNCs细胞增殖 将hPMSCs+PBMNCs细胞以1×104/孔接种于96孔板，分为4组：空白组(等量培养液)，PBMNCs组，PBMNCs+PHA组，hPMSCs+PBMNCs+PHA组，每组3个复孔，37℃恒温培养72 h后，各孔加入20 μl MTT(5 g/L)溶液，在37℃培养箱中孵育4 h后，弃净上清液，每孔加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，充分溶解后，测定490 nm波长处各孔的吸光度(A)值。

1.3.5ELISA检测hPMSCs+PBMNCs细胞IL-10、IFN-γ水平1.3.2中hPMSCs+PBMNCs细胞共培养72 h后，用ELISA法检测IL-10、干扰素(IFN)-γ水平，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3.6流式细胞术检测hPMSCs+PBMNCs细胞淋巴细胞亚群1.3.2中hPMSCs+PBMNCs细胞共培养72 h后，用0.25%胰蛋白酶消化5 min，PBS-CMF漂洗3次，取100 μl(1×107/ml)分装，然后加入单克隆抗体IgG1-PE、IgG2a-FITC、CD4-FITC、CD8-PE，避光静置20 min，PBS漂洗3次，最后进行流式细胞仪检测。

1.4统计学方法 应用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1hPMSCs的形态学特征 hPMSCs在换液后贴壁生长，接种48 h换液后只有少量细胞贴壁，3 d呈分散细胞克隆，7～10 d细胞克隆大量繁殖，细胞直径增大，细胞胞质透明、核质比大、呈涡旋状生长。取第3代(P3)hPMSCs于倒置显微镜下观察(图1)，细胞形态均为长梭形，涡旋式生长，与成纤维细胞外观相似。上述特征符合MSCs典型细胞形态。

图1 hPMSCs的形态学特征(×300)

2.2hPMSCs特异性抗原鉴定 流式细胞术检测结果显示，hPMSCs细胞表达CD73、CD90、CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR，具有典型MSCs表面标志。见图2。

图2 hPMSCs表面标志检测结果

2.3hPMSCs对患者PBMNCs增殖的影响 在倒置显微镜下，经PHA活化的PBMNCs细胞T细胞克隆性繁殖，成簇生长。空白组OD值0.07、PBMNCs组OD值0.60、PBMNCs+PHA组OD值1.26、PBMNCs+PHA+hPMSCs组OD值0.68。PBMNCs+PHA+hPMSCs组与PBMNCs+PHA组比较，PBMNCs细胞增殖水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4对患者PBMNCs细胞IL-10、IFN-γ的影响 PBMNCs+PHA+hPMSCs组细胞因子IL-10水平显著高于PBMNCs+PHA组，细胞因子IFN-γ水平显著低于PBMNCs+PHA组(均P<0.05)。见表1。

表1 hPMSCs对患者PBMNCs细胞IL-10、IFN-γ的 影响

2.5对患者PBMNCs细胞T细胞亚群的影响 流式细胞术检测结果显示，与hPMSCs细胞共培养后，PBMNCs+hPMSCs组CD4+、CD8+T细胞水平明显降低，显著低于PBMNCs组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 hPMSCs对患者PBMNCs细胞T细胞亚群的 影响

3 讨 论

近年来，干细胞研究与临床应用发展迅速，受到广泛关注。多数发达国家在生命科学与干细胞的临床研究中投入巨大，并取得突破性进展。研究表明〔7，8〕，不同种类不同来源的干细胞具有不同的生物学特性，可诱导性不同，可分化为合适的细胞，分泌各种生长因子和细胞因子，对受损区域进行修复。

MSCs来源广泛，几乎存在于人体所有组织与器官，比较容易获得。而且，MSCs具有自我更新、多向分化潜能、免疫调节功能及抗炎等特点〔9，10〕，在临床治疗ALI这类目前尚无有效治疗手段的疾病方面有巨大潜能。有研究发现〔11～13〕，MSCs可向受损、炎症及肿瘤组织等部位迁移，通过分泌诸多因子(趋化因子、免疫抑制因子、细胞外基质蛋白等)，作用于活化的免疫细胞，修复损伤部位，抑制炎症反应，参与ALI等疾病的治疗。hPMSCs相对于其他来源的MSCs，不仅取材容易而且对人体没有伤害，不涉及道德伦理与法律问题，是理想的干细胞治疗来源。

本研究结果表明hPMSC培养分离成功。Zheng等〔14〕研究发现，中性粒细胞和肺部炎症因子对肺部微血管内皮可造成破坏作用，进而使得内皮通透性增加，MSCs可改善炎症因子对肺微血管内皮的破坏。吴海青等〔15〕用MSC处理ALI小鼠，发现小鼠炎症反应程度降低，且MSCs移植对大鼠无明显毒副作用。本研究表明hPMSCs可在一定程度上降低ALI患者的炎症反应，抑制T细胞的免疫反应。hPMSCs作为ALI临床治疗策略还有很长的路要走，最终能否成功可能取决于对hPMSCs作用机制的更多了解。