王蓓 代聪伟 李娜 杨艳艳 秦英

(河北省人民医院妇科，河北 石家庄 050051)

NDRG1基因，也称为Drg-1,Cap43,RTP,Rit42 and PROXY-1，属于NDRG基因家族。这个家族由四个基因组成：NDRG1，NDRG2，NDRG3，NDRG4。其余三个基因与NDRG1是同源性基因，有57%～65%相似性〔1〕。NDRG1，是43 kD蛋白，由394个氨基酸组成，广泛存在于多细胞生物的正常细胞和肿瘤细胞的细胞质中〔2〕。NDRG1表达与肿瘤发生、发展及转移关系的相关研究表明：NDRG1在抑制肿瘤转移的过程中发挥着重要的作用〔3,4〕。但有关该方面的研究报道目前仍不多，而且也存在较大争议。NDRG1表达与肿瘤尤其在卵巢肿瘤转移的相关性如何，目前国内外尚未发现关于NDRG1与卵巢癌细胞OVCAR3的研究报道。本研究采用分子生物学方法，改变卵巢癌细胞OVCAR3中NDRG1的表达，分析其对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞株 人卵巢癌OVCAR3细胞株中国医学科学院肿瘤医院提供。

1.2试剂及仪器 细胞培养基RPMI1640、胎牛血清购自Sigma公司，Trizol试剂及LipofectamineTM 2000、RNA提取试剂购自Invitrogen 公司，Transwell小室购自Costar公司，RT-PCR试剂盒及引物购自Takara公司。质粒pcDNA3.1(+)/NDRG1和pcDNA3.1(+)为Clontech合成。

1.3细胞培养 OVCAR3细胞培养于37℃含5%CO2细胞培养箱内,培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640，0.25%胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜下观察细胞生长状态。

1.4实验方法

1.4.1细胞转染 细胞在RPMI1640培养液于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养生长。转染前1 d,胰酶消化细胞并计数,4×105/孔细胞接种于6孔板,当细胞融合度为80%时即可转染。转染时,按照Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)说明书进行转染,实验分3组：未转染组(control组)，阴性对照组〔pcDNA3.1(+)组〕，实验组〔pcDNA3.1(+)/NDRG1组〕。

1.4.2荧光定量PCR检测NDRG1在OVCAR3细胞中的表达 按 Trizol试剂盒说明书分别提取转染后48 h未转染组(control组)，阴性对照组〔pcDNA3.1(+)组〕，实验组〔pcDNA3.1(+)/NDRG1组〕细胞的总RNA。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)按照Takara 反转录PCR试剂盒说明书进行操作，反转录合成 cDNA 的第一条链,利用Primer5.0设计NDRG1的鉴定引物:上游引物5′-ACACCTACCGCCAGCACA-3′,下游引物：5′-GCCACAGTCCGCCATCTT-3′,扩增片段长度245 bp。PCR扩增条件为:95℃预变性10 min，95℃ 15 s，退火58℃ 20 s，延伸72℃ 27 s，40个循环。以β-actin作为内参照。上游引物:5′-ACTTAGTTGCGTTACACCCTT-3′,下游引物:5′-GTCACCTTCACCGTTCCA-3′,扩增片段长度为156 bp。以上两对PCR引物均由Takara公司合成。PCR结束后得出Ct值，分析各组之间NDRG1基因的mRNA表达水平差异。

1.4.3Western印迹检测 将收集的细胞用含非离子去垢剂的缓冲液充分裂解，进行蛋白定量，取50 μg处理好的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；100 V恒压转膜2 h；5 %脱脂奶粉室温封闭1 h；将膜与抗 NDRG1抗体室温孵育1 h，4℃过夜；TBST缓冲液洗膜3次，每次15 min，加入二抗室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次；化学法发光,胶片显色，用Fluorochem E分析结果。以β-actin作为内参照。

1.4.4RT-PCR检测各组细胞p21及p53基因的mRNA表达 取各组细胞，同上述抽提总RNA，进行逆转录及PCR。PCR引物如下：p21上游引物为:5′-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3′;下游引物为:5′-CGCTATCTGAGCAGCGCTCAT-3′;产物243 bp。p53上游5′GCGCACAGAGGAAGAGAATC-3′，下游5′-GGCCAACTTGTTCAGTGGAG-3′，产物501 bp。内参为β-actin同1.4.2。每一样本的最后结果为3次独立电泳实验的平均值。

1.4.5Western印迹法检测各组细胞p21及p53及基因的蛋白表达 取各组细胞，具体过程同上述。一抗为鼠抗人p21单克隆抗体(1∶200)及鼠抗人p53单克隆抗体(1∶200)，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(1∶5 000)。每一样本的最后结果为3次独立电泳实验的平均值。以β-actin作为内参照。

1.4.6流式细胞术检测细胞周期 将转染后的各组细胞用不含EDTA的胰酶消化成单细胞悬液；具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行，加入碘化丙啶(PI，浓度为 100 mg/L)溶液染色20～30 min 后，在流式细胞仪上进行检测分析。

1.4.7流式细胞术检测细胞凋亡 将转染后的各组细胞用不含EDTA的胰酶消化成单细胞悬液；具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，每组细胞重复检测4次。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验、方差分析法、LSD-t法。

2 结 果

2.1PCR检测NDRG1 mRNA表达 pcDNA3.1(+)/NDRG1组中NDRG1 mRNA相对表达量(1.00±0.03)明显高于control组(0.57±0.04)和pcDNA3.1(+)组(0.59±0.02，P<0.05)。

2.2Western印迹检测转染NDRG1过表达载体后细胞中蛋白表达的变化 在使用NDRG1过表达载体pcDNA3.1(+)/NDRG1和空载体pcDNA3.1(+)分别转染OVCAR3细胞，并使用RT PCR和Western印迹方法鉴定转染效果，结果表明：control组和转染pcDNA3.1(+)空载体的OVCAR3细胞中NDRG1表达量与转染过表达载体pcDNA3.1(+)/NDRG1组相比显著降低(0.46±0.02、0.49±0.03、1.85±0.05，P<0.05)，见图1。

2.3NDRG1作用后卵巢癌细胞OVCAR3中p21及p53基因的mRNA表达 control组、pcDNA3.1(+)组 NDRG1、p21及p53 mRNA表达均明显低于pcDNA3.1(+)/NDRG1组(P<0.05)，见表1。

1～3：control组，pcDNA3.1(+)组，pcDNA3.1(+)/NDRG1组，下图同图1 各组OVCAR3细胞NDRG1表达水平比较

表1 各组卵巢癌细胞OVCAR3中p21及 p53基因的mRNA表达

2.4NDRG1作用后卵巢癌细胞OVCAR3中p21及p53基因的蛋白表达 control组及pcDNA3.1(+)组NDRG1、p21及p53的表达均明显低于pcDNA3.1(+)/NDRG1组(P<0.05)，见表2，图2。

表2 各组OVCAR3细胞NDRG1蛋白表达水平比较

图2 各组OVCAR3细胞NDRG1、p21及 p53基因表达水平比较

2.5流式细胞仪检测细胞周期 pcDNA3.1(+)/NDRG1组细胞与control组、pcDNA3.1(+)组相比，G0/G1期细胞数明显增多,而S期细胞数减少，差异均有统计学意义(均P<0.05)，G2/M期细胞数无明显变化(P<0.05)。见表3。

表3 流式细胞仪检测各组OVCAR3细胞 周期

2.6流式细胞仪检测卵巢癌细胞OVCAR3细胞凋亡的影响 与control组、pcDNA3.1(+)组比较，pcDNA3.1(+)/NDRG1组细胞凋亡率明显增加(P<0.05)，而control组pcDNA3.1(+)组之间细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)，见表4。

表4 流式细胞仪检测各组OVCAR3 细胞凋亡

3 讨 论

本研究说明人卵巢细胞癌OVCAR3细胞受到质粒pcDNA3.1(+)/NDRG1转染的影响，出现细胞周期阻滞。细胞凋亡数据表明，发现上调NDRG1基因后OVCAR3细胞凋亡率显著提高；本研究结果说明过表达NDRG1可以显著增加OVCAR3细胞凋亡，使细胞周期发生改变，诱导细胞凋亡，证明了NDRG1在卵巢癌细胞中可能作为抑癌基因发挥着肿瘤抑制作用。

很多文献表明，NDRG1作为一种肿瘤抑制基因，在转移瘤中NDRG1基因的低表达，由N-myc下调实现，并且也可由过表达HIF-1、p53等多种转录因子实现〔5〕。细胞中DNA损伤后，NDRG1表达是通过p53介导途径来实现的，此过程对p53介导的凋亡是非常必要的条件之一〔6〕。在胰腺癌的相关研究中证实，NDRG1基因表达较低的细胞株比表达高的细胞株侵袭迁移能力明显增强〔7〕。人肝细胞肝癌中NDRG1的过表达与肿瘤的侵袭性和预后差关系密切，提示NDRG1在肝癌中具有加速肿瘤生长的作用；低表达肝癌细胞株中NDRG1可使细胞的增殖和侵袭作用显著受到抑制，并可以诱导细胞凋亡，表明NDRG1基因具有抗凋亡作用〔8〕。然而，很多研究证明，肿瘤组织中NDRG1的表达与正常细胞差异不大或稍有下降〔9〕。NDRG1基因的下调与结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌等患者愈后不良关系密切〔10～16〕。

p21基因是一种抑癌基因，作为细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CKIs)家族中的一员，是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的CKIs，不仅在子宫内膜癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤组织中不表达或表达减少，而且与肿瘤分化程度、侵袭转移能力关系密切〔17〕。MDM2主要与p53蛋白相结合，参与调节细胞增殖及凋亡的多种信号通路。很多恶性肿瘤组织中MDM2表达异常，MDM2的过度表达与肿瘤发生发展及预后较差关系密切，MDM2今后也可能成为肿瘤治疗的另一个新靶点〔18〕。Kovacevic等〔19〕学者认为，利用脂质体介导的方法将NDRG1基因导入人前列腺癌PC3MM细胞株中，结果证实细胞凋亡加速而增殖明显下降，分子机制可能与NDRG1通过非p53依赖信号通路来调节p21的表达密切相关。在非转移瘤中p53的改变可调节NDRGl的表达，而在转移瘤细胞中通过细胞内钙离子释放来调节其表达，这个过程不依赖p53的表达〔20〕。另外，NDRG1的低表达可消除p53基因介导的细胞凋亡作用，表明 NDRG1基因与细胞的多种传导通路关系密切。

NDRG1基因不仅存在于多种正常细胞和组织中，在其生长发育过程中发挥着较为重要的作用，并且在肿瘤细胞和组织的发生发展中也起着至关重要的作用〔21〕。人类很多肿瘤组织中，如肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等，NDRG1 基因都呈现低表达〔22～25〕；但是，NDRG1转染到肿瘤细胞中，可使肿瘤细胞的生长呈现显著抑制。也有研究证实，通过流式细胞仪研究正常细胞中NDRG1的表达出现周期性变化，在G1期和G2/M期达到较高水平，而在S期则呈现较低表达〔26〕；然而，在肿瘤细胞中并没有发现NDRG1表达呈现周期性表达，在细胞周期表达中出现均一性，这表明NDRG1被转染到人肿瘤细胞株中可使细胞周期受到阻滞，同时可以诱导细胞出现凋亡的改变。