明思彤 刘柳 阚默 王继凤 张壮 刘晓冉 杨擎 林嘉楠 李娜 曲晓波

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2吉林省药品审评中心)

心肌肥厚能够提高心律失常、心力衰竭(心衰)、心脏猝死的发生概率，是心血管疾病发病率和死亡率的预测指标〔1〕。心肌肥厚前期表现为心悸、胸闷，后期常表现呼吸困难、喘息不止等，这在中医理论中属于“胸痹、喘证、水肿”等范畴，目前，中医将此病归于气阴两亏型、气虚血瘀型等证型〔2〕。

传统复方生脉饮来源于《医学启源》，是治疗气阴两虚证的代表方剂〔3〕。生脉饮(党参方，SMY)是由传统人参方衍生而来，由党参、麦冬、五味子组成，同样具有益气复脉，养阴生津的功效。研究表明〔4〕SMY能增强心肌收缩力，防止心室重构，从而保护心脏，常用于心衰、心肌炎、冠心病等疾病。

网络药理学是基于系统生物学、生物信息学等方面的理论，从整体水平上观察“药物-疾病-靶点”的网络关系模型，从而可以研究中药作用靶点及作用机制，其概念与中医药整体观和辨证论治的原则相贴合〔5〕。为明确SMY治疗心肌肥厚的生物学机制，本文基于网络药理学研究方法对SMY治疗心肌肥厚的生物学物质基础及药效机制进行预测，并通过动物实验进行验证，阐明SMY治疗心肌肥厚的分子作用机制。

1 资料及方法

1.1实验动物 SPF级SD大鼠50只，雌雄各半，体重(200±10)g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司(动物合格证号：201900030925，伦理号：20190125)。饲养于长春中医药大学动物饲养中心，温度20～22℃，相对湿度(50±10)%。

1.2药物与试剂 SMY(北京同仁堂药业，国药准字Z11020372)；复方丹参片(百年六福堂药业，国药准字Z22022898)；异丙肾上腺素(ISO，Solarbio，货号：I8480)；磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抗体(Proteintech，货号：60225-1-lg)；蛋白激酶B(AKT)抗体(Proteintech，货号：60203-2-lg)；哺乳动物雷帕霉素靶基因(mTOR)抗体(BOSTER，货号：BM4182)；P-PI3K抗体(Bioss，货号：bs-3332R)；P-AKT抗体(Bioss，货号：bs-2720R)；P-mTOR抗体(Bioss，货号：bs-3495R)，β-actin抗体(Bioss，货号：bs-0061R)。

1.3仪器 蛋白电泳仪(Hoffer)，转膜仪(Bio-Rad)，酶标仪(TECAN)。

1.4SMY中药物化学成分收集与筛选 采用中药系统药理学数据库平台TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以SMY方中“党参”、“五味子”为关键词在“Herb name”条目中检索其化学成分，根据TCMSP数据库官方建议的化合物分子ADME参考值，以其参数中的口服生物利用度(OB)≥20%、类药性(DL)≥0.1为限制条件进行筛选，并以方中“麦冬”为关键词在TCMID(https：//omictools.com/tcmid-tool)上检索，获得有效化学成分。综上获得SMY的有效化学成分信息，并以此作为SMY的候选活性成分。

1.5SMY活性成分候选靶标对应基因的收集 在TCMSP平台获得“党参”，“五味子”的潜在作用靶点蛋白全称，借助Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)对潜在靶点进行基因名称的注释，并下载由平台查询得到的化合物与在TCMID平台查询到的“麦冬”化合物输入到SwissTargetPrediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)查询相应靶点，最后将以上数据库查询结果整理合并，确保数据的完整性。

1.6心肌肥厚相关靶标基因的收集 通过人类基因组注释(GeneCards)数据库(https：//www.genecards.org/)和《人类孟德尔遗传》数据库(https：//omim.org/)，以“myocardial hypertrophy”为关键词，将得到的疾病相关基因进行去重整理作为心肌肥厚疾病相关基因。将检索获得心肌肥厚的基因与SMY主要活性成分所对应的候选靶标基因取交集，获取两者的共有基因作为SMY治疗心肌肥厚的潜在作用靶标。

1.7“药物-活性成分-作用靶标-疾病”网络构建与分析 将筛选后的药物活性成分与治疗心肌肥厚的潜在靶标构建相应的数据表，以构建的关系数据表作为Cytoscape3.7.2的输入文件构建化合物成分及潜在作用靶点网络图，构建药物-活性成分-作用靶标-疾病网络图，展示药物活性成分与心肌肥厚靶标间的作用关系。

1.8靶蛋白互相作用网络图(PPI)构建 将SMY治疗心肌肥厚的潜在作用靶标导入String数据库，限制物种为“Homo sapiens”，设置节点combine score≥0.4，同时去除孤立的靶点蛋白，获取蛋白互作关系数据。将所得数据导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理，通过Network Analyzer工具进行网络分析从而获得Degree值，绘制PPI网络图。

1.9GO富集及KEGG通路分析 将SMY对心肌肥厚的潜在作用靶标基因利用R语言Cluster profiler程序进行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析，设定P≤0.05得到相应的生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)及KEGG通路，利用R语言pathview可视化前20条生物学过程及通路气泡图。

1.10动物分组、给药及造模 将50只SD大鼠随机分为空白组(0.9%生理盐水)、模型组(ISO剂量递减20 mg/kg、10 mg/kg和5 mg/kg形式，皮下注射3 d，然后以3 mg/kg的剂量连续注射4 d)、阳性组(复方丹参片290 mg/kg+ISO)、SMY低剂量组(SMYL 3.26 g/kg+ISO)、SMY高剂量组(SMYH 13.04 g/kg+ISO)，每组10只。预先灌胃SMY和复方丹参片7 d，第8天除空白组外，其他所有组皮下注射ISO 7 d，造模期间继续灌胃SMY和复方丹参片，共灌胃14 d，空白组和模型组给予相同剂量的生理盐水。

1.11苏木素-伊红(HE)、Masson染色观察大鼠心脏病理情况 按1.10进行动物分组给药，将心脏组织置于4%多聚甲醛中固定，进行HE、Masson染色，用倒置显微镜观察大鼠心脏病理情况，并拍照记录。

1.12Western印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平 按1.10进行动物分组给药，将大鼠心脏组织处理后，用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，150 V，80 min，100 V转膜70 min，脱脂奶粉封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温摇床孵育1 h，洗涤后，用凝胶成像仪进行ECL化学发光显色，使用Image J分析软件测定条带强度值。各组蛋白表达的相对强度=磷酸化蛋白条带的灰度值/非磷酸化条带的灰度值进行定量分析。

1.13统计学分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1SMY候选活性成分及候选靶标 通过TCMSP数据库，根据OB和DL值筛选得到党参有效活性成分44个，五味子有效活性成分68个，然后将对应的化合物分子查询相应蛋白，党参潜在靶点450个，五味子560个，将所有蛋白全称经过Uniprot数据库标准化，共计得到775个相应基因。然后通过TCMID数据库，检索麦冬有效活性成分55个，得到麦冬对应基因4 910个，将所有化合物分子靶点合并去除重复值，共计得到720个。

2.2SMY活性成分治疗心肌肥厚相关靶标 在GeneCard数据库检索关键字“Myocardial hypertrophy”，结果得到相关基因共2 702个，设置Relevance score≥7，剩余542个相关基因。在OMIM数据库检索相同关键字，共得到40个基因与GeneCard结果合并，删除重复值，得到572个基因。将572个疾病相关基因和720个药物潜在靶点进行映射，获取两者之间的交集基因114个，构建药物与疾病之间的共有关系。

2.3“药物-化合物-疾病-靶标”的网络构建 图1网络中化合物与靶点相连的线称之为自由度(degree)，degree越高表明该节点(化合物或靶点)存在的相互作用关系越多。其中有32种化合物作用靶点数量>10，有芹菜素(Apigenin)、木犀草素(Luteolin)、鸢尾黄素(Tectorigenin)、7-甲氧基-2-甲基异黄酮(7-Methoxy-2-methylisoflavone)、2-甲氧基呋喃二烯(2-methoxyfuranodiene)、英西卡林(Encecalin)、灌木远志酮A(Frutinone A)、党参碱(Codonopsine)、腔肠素(Coelogin)、大豆黄素(Glycitein)、豆甾醇(Stigmasterol)、麦冬黄烷酮b(Ophiopogonanone b)、山梨醇(Orchinol)、麦冬皂苷b(Ophiopogonin b)、麦冬皂苷a(Ophiopogonin a)、麦冬黄烷酮e(Ophiopogonanone e)、麦冬黄烷酮a(Ophiopogonanone a)、麦冬黄烷酮c(Ophiopogonanone c)、鲁斯可皂苷元(Ruscogenin)、齐墩果酸(Oleanolicacid)、茉莉酮(Jasmololone)、反式阿魏酰酪胺(n-trans-feruloyltyramine)、25(S)-鲁斯可皂苷元-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(25(s)-ruscogenin1-o-alpha-l-rhamnopy-ranosyl-(1-2)-beta-d-xylopyranoside)、5-羟基-7,8-二甲氧基-6-甲基-3-(3′,4′-二羟基苄基)-4-色原烷酮(5-hydroxy-7,8-dimethoxy-6-methyl-3-(3′,4′-dihydroxybenzyl)chroman-4-one)、n-〔β-羟基-β-(4-羟基苯基)〕乙基-4-羟基肉桂酰胺(n-〔β-hydroxy-β-(4-hydroxyphenyl)〕ethyl-4-hydroxycinnamide)、5,7-二羟基-6,8-二甲基-3-(4′-羟基-3′-甲氧基苄基)-4-色原烷酮(5,7-dihydroxy-6,8-dimethyl-3-(4′-hydroxy-3′-methoxybenzyl)chroman-4-one)25(S)-鲁斯可皂苷元-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(25(s)-ruscogenin1-o-alpha-l-rhamnopy-ranosyl-(1-2)-beta-d-xylopyranoside)、25 (s) -ruscogenin1-o- 〔α-l-吡喃鼠李糖基- (1 → 2)〕〔β-d-吡喃木糖基- (1 → 3)〕 - β-d-吡喃岩藻糖苷(25(s)-ruscogenin1-o-〔α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)〕〔β-d-xylopyra-nosyl-(1→3)〕-β-d-fucopyranoside)、n-(反式-对-香豆酰)酪胺(n-(trans-p-coumaroyl)tyramine)、紫草蛋白(Arnebin)7、五味子素R(Gomisin R)，结果表明SMY可通过多成分、多靶点联合调节的方式治疗心肌肥厚。

2.4PPI 图2中节点表示蛋白，边表示功能相关性。该网络由114个节点、1 948条边组成，各节点degree平均值为34.18，Closeness平均值为0.58，Betweenness平均值为0.006 9。Degree、Closeness及Betweenness值均超过平均值的靶点有16个，包括INS、IL6、AKT1、GAPDH、VEGFA、CASP3、MAPK1、TP53、TNF、EGFR、PTGS2、IL1B、SRC、FOS、PPARG、mTOR。预测这些核心治疗靶点在该网络中发挥关键调控作用。

绿色四边形：党参活性成分；蓝色菱形：麦冬活性成分；紫色三角形：五味子活性成分；粉色椭圆形：交集靶点；红色六边形：心肌肥厚图1 “药物-成分-疾病-靶标”网络图

图2 靶蛋白互作网络图

2.5SMY中靶标基因GO富集分析 GO分析结果提示SMY-心肌肥厚-基因的BP显著富集在脂多糖反应、炎症反应、正调控蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等。MF主要富集在细胞因子受体结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、生长因子受体结合等。CC主要富集在细胞膜筏、细胞质囊泡腔、质膜等中。根据Count值由大到小，同时满足P<0.05进行排序，分别在BP、MF和CC中选出排名前20的条目，见图3～5。

图3 SMY中靶标基因GO富集分析中生物过程

2.6SMY治疗心肌肥厚关键靶点KEGG通路富集分析 KEGG富集分析得到的通路根据P<0.05并结合相关文献〔6～8〕进行筛选。KEGG通路富集分析结果表明，主要涉及PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、IL-17信号通路等信号通路。SMY可能通过作用于这些通路起到防治心肌肥厚的作用。根据满足P<0.05，Count值由大到小到进行排序，列出前20的信号通路，见图6。

图4 SMY中靶标基因GO富集分析中分子功能

图6 SMY治疗心肌肥厚关键靶点的KEGG通路富集分析

2.7SMY对心肌肥厚大鼠生长曲线的影响 空白组进食和饮水正常，毛色有光泽，外观正常，体重增加较快。随着实验进行，模型组逐渐出现进食量减少，活动减少，呼吸急促等现象，体重增加缓慢。阳性组和SMY低、高剂量组体重增加明显加快。见图7。

图7 SMY对心肌肥厚大鼠生长曲线的影响(n=10)

2.8SMY对心肌肥厚大鼠心脏组织HE、Masson染色的影响 空白组心肌细胞结构规则，纤维排列紧密。模型组心肌细胞伴有肿大、坏死及炎性浸润，且可见大量蓝色片状胶原纤维，心肌组织纤维化严重，出现纤维排列紊乱等现象。阳性组，SMY低、高剂量组心肌细胞及纤维结构破坏程度、纤维化面积较模型组明显改善，表明SMY可改善ISO诱导大鼠心肌肥厚、损伤以及纤维化。见图8。

图8 SMY对心肌肥厚大鼠心脏组织HE、Masson染色的影响(×400)

2.9SMY对心肌肥厚大鼠心脏组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达水平的影响 与空白组相比，模型组PI3K、Akt、mTOR显著磷酸化(P<0.01，P<0.001)。与模型组相比，SMY可显著降低Akt、mTOR、PI3K磷酸化水平(P<0.01，P<0.001)。见表1,图9。

表1 SMY对心肌肥厚大鼠心肌中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达水平的影响

1～5:空白组、模型组、阳性组、SMY低剂量组、SMY高剂量组图9 SMY对心肌肥厚大鼠心肌中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达水平的影响

3 讨 论

本研究发现有32种化合物是重要的药效靶点。其中apigenin、luteolin、7-Methoxy-2-methylisoflavone、ophiopogonanone均为黄酮类化合物，具有显著抗炎和抗血小板聚集等心血管保护作用〔9〕。来源于党参成分的luteolin能够显著逆转阿霉素损伤所致的心肌收缩力降低、心肌细胞凋亡，并能显著抑制Caspase-3表达〔10〕。Luteolin、Stigmasterol及麦冬主要成分ophiopogonin可作用于Akt1，通过PI3K/Akt/eNOS途径增加NO的释放量来诱导心肌缺血血管的再生〔11〕。构建SMY对心肌肥厚114个潜在靶点PPI网络，其中IL-6能与83个蛋白发生相互作用，degree值跟随其后的AKT1、Caspase-3、TNF、TP53、mTOR分别能与80、75、71、71、50个蛋白相互作用。炎症是心室肥厚的关键标志〔12〕。TNF-α心肌细胞特异性功能增强会引起心肌肥大和纤维化，导致扩张性心肌病，并伴有心脏功能障碍〔13〕。研究表明〔14〕，小鼠体内IL-6和IL-6受体的过度表达诱导心脏肥大、纤维化和舒张功能障碍。参与调控心肌细胞凋亡的基因有Bcl-2/Bax、Caspase-3和p53等。李益萍等〔15〕发现生脉注射液可明显逆转AngⅡ致心肌细胞中Caspase-3 mRNA的表达。TP53(P53)是一种抑癌基因，在细胞凋亡过程中发挥重要作用。研究表明〔16〕，p53基因通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白的表达进而使细胞发生凋亡。

通过KEGG富集分析筛选出的最有意义的信号通路(P值最小，Count值最大)，即PI3K/Akt/mTOR信号通路并进行相关蛋白验证。PI3K/Akt/mTOR信号通路与多种细胞功能相关，包括细胞生长、增殖、分化、存活和细胞内运输等〔17〕。心肌细胞中的PI3K激活与控制细胞生长、存活和代谢的生物学过程密切相关；心脏中PI3K激活加剧了心肌肥大和功能障碍，而缺乏PI3K可减弱生理性心肌肥大〔18〕。PI3K激活后的心肌肥大反应与PI3K下游的Akt相关〔19〕，Akt是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，参与代谢、葡萄糖摄取、细胞增殖和蛋白质合成等多种细胞功能的调节。Akt是引起心肌肥大的关键靶标分子，心脏中活性Akt的靶向过度表达导致心肌细胞变大和心肌肥厚，增强心脏Akt信号转导会促进病理性肥大并逐渐抑制线粒体脂肪酸氧化〔20〕。Akt通过调节PI3K-Akt信号通路来促进心肌肥大，真核翻译起始因子4E结合蛋白(4E-BP)1抑制翻译的启动并受mTOR负调控，mTOR是一种大的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，PI3K-Akt-mTOR信号转导抑制4E-BP1并促进心肌肥大。mTOR由Akt磷酸化TSC2激活，mTOR及其下游靶标的激活会导致心肌细胞变大，与心肌肥厚的进程有关〔21〕。

本研究基于网络药理学方法阐述了SMY对心肌肥厚大鼠的保护作用及分子机制。结果表明SMY通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路保护心脏，改善心功能。另外GO和KEGG富集分析还预测了SMY参与调控心肌肥厚的血管生成、氧化应激、胰岛素受体底物结合等途径，同时可能作用于HIF-1信号通路、MAPK信号通路等达到防治心肌肥厚的作用，故可据此开展进一步的实验探索。