许苗菁 钟花 赵振强 陈薪旭 冯晓丽 张海英 王埮

(海南医学院 1第一附属医院神经内科，海南 海口 570102;2海南热带脑科学研究与转化重点实验)

Sodium butyrate improving the motor function and decreasing the anxiety-like behavior in mice damaged by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine (MPTP)

XU Miao-Jing, ZHONG Hua, ZHAO Zhen-Qiang,etal.

Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the influences of sodium butyrate (NaB) on motor function and anxious behavior of PD model.MethodsMice were divided into control, model, NaB groups. Control group of mice were intrapertioneally injected with saline for 28 days, model group of mice were injected with MPTP intrapertioneally for 14 days and continued to inject with saline for 14 days, NaB group of mice were injected with MPTP intrapertioneally for 14 days and continued to inject with NaB for 14 days. The behaviour experiment of mice were measured by rotarod test, pole test and open field. Western blot and immunochemistry were used to detect expression of TH protein in brains of mice.ResultsIn the rotarod test, the time on the rotarod of model mice were shorter than that of normal group, however the time of NaB group were increased significantly than that of model group. In pole test, compared with normal mice, the time to climb pole of model mice were significantly prolonged. In contrast, the time of NaB group of mice were shorter than that of model group. In open field, the numbers of crossing the middle region of model mice were less than that of control group, but were increased in NaB group. In addition, the total distance of model group was reduced compared with control group, while NaB group of mice were increased. In Western blot and immunochemistry test, compared with control group, TH expression of model mice was decreased, while it was increased in NaB group.ConclusionsNaB could increase the expression of TH in brain of MPTP model mice, reduce the loss of dopamine neurons, and improve the motor function and decrease the anxiety-like behavior in mice.

【Keywords】 Parkinson disease; Sodium butyrate;1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine; Motor function; Anxiety-like behavior

中脑黑质多巴胺神经元缺失是帕金森病(PD)病理特点〔1〕。PD症状分运动症状和非运动症状，非运动症状包括焦虑，抑郁、睡眠障碍等〔2〕。目前PD因机制未能完全明确，针对性的治疗一直是研究热点。丁酸钠(NaB)是一种去乙酰化酶抑制剂，也是一种重要神经保护剂，其对多种神经系统疾病包括PD具有一定的保护作用〔3～7〕。目前对丁酸钠改善PD小鼠模型非运动症状，尤其是焦虑行为的改善作用未能完全明确，本文通过5，1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP )构建 PD 小鼠模型，探究 NaB 通过减少多巴胺神经元丢失，进一步对PD小鼠运动及部分非运动症状的影响及作用。

1 材料与方法

1.1动物与材料 动物：150只SPF级C57小鼠，体重(20.09±0.39)g，8～10周龄，由华中农业大学提供，室温21～23℃、湿度55%～60%SPF级动物房养殖，12 h昼夜节律，自然光照，自由饮水进食。小鼠随机分为正常组、模型组和给药组各50只。主要材料：MPTP及NaB粉末购自美国Sigma；酪氨酸羟化酶(TH)抗体及β肌动蛋白(β-actin)抗体购自美国CST；苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白测量试剂盒、电化学发光液(ECL)购自碧云天；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉生物有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore；全自动数码凝胶图像分析系统购自天能科技有限公司；病理切片机购自莱卡；正置光学显微镜购自日本奥林巴斯；小鼠旷场实验轨迹分析仪器购自上海欣软信息科技有限公司；小鼠转棒实验仪器购自安徽正华生物仪器设备有限公司。

1.2MPTP腹腔注射构建PD 小鼠模型 MPTP 粉末配制成 5 mg/ml 浓度溶液，小鼠称重后，按25 mg/kg进行腹腔注射，持续注射14 d。正常组腹腔注射生理盐水14 d。

1.3药物干预 建模后，NaB粉末配制成240 mg/ml，按 1 200 mg/kg 进行腹腔注射，持续14 d，正常组和模型组腹腔注射生理盐水14 d。

1.4行为学检测

1.4.1转棒实验 设置转棒装置参数为3～30 r/min，逐渐加速，最长时间5 min。实验前3 d，小鼠预先进行适应性训练。实验当天，小鼠预先在滚棒上适应30 s，然后启动装置，系统会自动记录小鼠掉落时间。每只小鼠重复检测3次，每次间隔1 min，计算平均掉落时间。实验间隔使用75%乙醇消除气味。

1.4.2爬杆实验 取一长50 cm，直径为1 cm表面粗糙木杆，在顶端固定一直径2.5 cm 的泡沫小球，与地板倾斜度呈45°放置，将小鼠放置于顶端的泡沫小球上，记录其从顶端到爬完杆时间。在实验前3 d，预先使小鼠进行适应性训练，然后开始实验。实验间隔使用75%乙醇清除气味。每只小鼠重复检测 3 次，中间间隔 1 min，取3次检测结果的平均值作为最终的爬杆时间。时间越长，说明运动功能越差。

1.4.3旷场实验 取一500×500×300 mm3实验箱子，实验操作室上方装有摄像机，连接轨迹分析仪，实验开始后，摄像机可完全记录小鼠行动轨迹，传至分析仪，分析仪会对小鼠在箱子总路程及小鼠进入中间区域次数进行计算。

1.5Western印迹 小鼠完善行为学后，苯巴比妥腹腔麻醉后，经冰生理盐水小鼠心脏灌注后取鼠脑，分离得到中脑黑质，液氮速冻，以50 mg/ml比例加入含有PMSF裂解液，经超声裂解后得到总蛋白。采用BCA试剂盒测蛋白浓度，取部分蛋白溶液，加入上样缓冲液，沸水中变性3 min。微量器加量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，PVDF转膜，一抗(抗TH)4°孵育过夜，次日，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入二抗，室温孵育2 h,凝胶成像仪显影拍照，使用Image J进行灰度值分析。

1.6免疫组化 小鼠完善行为学后，苯巴比妥腹腔麻醉后，冰生理盐水小鼠心脏灌注及4%多聚甲醛内固定后迅速取出鼠脑，放入预冷4%多聚甲醛进行外固定，经不同梯度浓度乙醇进行脱水，浸蜡包埋。莱卡切片机切片，使得石蜡片厚度为6 μm。石蜡片经脱蜡水化，抗原修复、封闭等步骤后，使用一抗(抗TH抗体)4℃进行孵育过夜，次日，二抗室温下孵育30 min,DAB 显色，苏木素复染，经不同浓度乙醇脱水及二甲苯透明后，中性树脂进行封片。最后显微镜下观察TH染色情况。

1.7统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、LSD 检验。

2 结 果

2.1NaB 改善 PD 模型小鼠运动症状 模型组转棒停留时间明显比正常组短(P<0.001)，而药物组则显著延长(P<0.001)。模型组爬杆时间比正常组显著延长(P<0.001)，丁酸钠组爬杆时间比模型组显著缩短(P<0.001)。见表1。

表1 3组转棒及爬秆时间比较

2.2NaB 改善 PD 小鼠焦虑行为 模型组穿越中间区域次数较正常组显著减少(P<0.01)，药物组则较模型组显著增多(P<0.05)。相对于正常组，模型组总路程显著减少(P<0.01)，而给药组则比模型组明显增加(P<0.05)。见表2。

表2 3组旷场实验穿越中间区域次数及 总路程比较

2.3NaB 减少多巴胺神经丢失 Western印迹结果显示，模型组鼠脑 TH(0.75±0.093)表达较正常组(1.67±0.10)明显下降(P<0.001)，而给药组(1.20±0.021)则较模型组表达显著上升(P<0.01)。免疫组化实验中，模型组鼠脑 TH(81.00±10.21)表达较正常组(161.33±12.34)明显下降(P<0.01)，而给药组(130.66±11.57)则较模型组表达显著上升(P<0.05)。见图1，图2。

图1 Western印迹检测 TH 表达

图2 免疫组化检测TH表达(×10)

3 讨 论

PD是两大神经系统退行性病变之一，发病率仅次于阿尔茨海默病〔8〕。PD在年龄超80岁人群中发病率为1%～4%〔9〕，超65岁人群中发病率为2%～3%〔10〕。但在65岁以下，PD患病也逐渐增多，发病在45～65岁PD人群称为早发型PD，除此之外，21～45岁PD病例也有报道〔11〕。PD在老年人中发病率高，严重影响患者生活质量。但有关PD发病机制未被阐明，既往研究表明PD发病与神经研炎症、氧化应激及线粒体功能失调等相关〔12～17〕。虽然PD病因未明，但炎症、年龄、基因、环境等均被认为涉及PD发生发展进程〔18～20〕。鉴于其复杂的发病机制及病因，对PD治疗仍为难题，现今治疗主要是药物替代治疗为主，如左旋多巴等，但目前的治疗方案只能延缓病情，而无法阻止病情进展。

MPTP是β单胺氧化酶产物，可以代谢成为活性神经毒物1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)〔21〕，作用于神经元线粒体电子传递链，产生活性氧(ROS)及炎症，可导致动物脑内多巴胺神经元死亡。因而常用来构建PD动物模型〔22,23〕；He等〔24〕实验中腹腔注射MPTP小鼠出现运动及焦虑行为；鲍宇等〔25〕运用MPTP刺激食蟹猴，构建PD慢性疾病模型，同样发现食蟹猴出现随意运动受限、动作迟缓、焦虑抑郁等行为。在本研究中采用对小鼠进行腹腔注射MPTP构建PD小鼠模型。

PD主要以运动症状为主，包括静止性震颤、肌强直、姿势障碍等。非运动症状包括焦虑、抑郁、便秘及睡眠障碍等。为了验证模型成功性，在本研究中，选择爬杆实验及转棒实验对 PD 小鼠进行运动功能检测，结果说明 MPTP 小鼠运动功能严重受损，这与既往研究一致〔7〕。除了运动功能受损外，本研究选择旷场实验来检测小鼠是否存在焦虑，结果表明其较正常小鼠焦虑行为增加。

TH 作为限速酶，可以催化酪氨酸转变为左旋多巴，调节多种神经递质的合成，如：多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等〔26〕。临床数据显示纹状体内 TH 表达下降是 PD 患者重要标志，随着多巴胺神经元丢失，TH 活性也进行下降〔27〕。因此研究认为 TH 是多巴胺神经元标志之一。本实验说明MPTP 小鼠模型可成功再现 PD 相关表型。

NaB是一种短链脂肪酸，主要是由结肠共生菌(酪酸梭菌等)发酵食物纤维的代谢产物〔28〕，同时它也是一种重要的去乙酰化酶抑制剂(HDACi)〔4〕，可调控多种基因表达。Liu 等〔7〕发现 NaB 可促进结肠分泌胰高血糖肽(GLP)-1及颅脑内胰高血糖肽-1 受体(GLP-1R)表达，通过脑肠轴发挥 PD 小鼠神经保护作用；同时该研究发现NaB 可上调胞质蛋白(ZO)-1,ZO-2,ZO-3和跨膜蛋白表达，减轻PD小鼠血脑屏障的破坏程度；此外，NaB 还可调控凋亡蛋白Bcl2 和 Bax 比例，减少细胞凋亡，最终改善 PD 小鼠的认知功能及运动功能。相关实验显示 NaB 可增加细胞周期蛋白激酶(CDK)6表达，提高D3细胞周期蛋白(D3)/周期蛋白依赖激酶(CDK6)/磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)信号通路活性，改善 6-羟多巴胺(OHDA，一种很强儿茶酚胺能神经毒性药物)对人神经母细胞瘤细胞的存活率的影响〔29〕。本研究结果表明 NaB 可显著改善 PD 小鼠运动功能。

焦虑行为是PD常见非运动症状，目前有效减轻 PD 病人焦虑的有效药物较少。本实验发现，NaB 可减轻模型鼠的焦虑行为。由此可得出，NaB不仅能改善 PD 小鼠运动功能，而且在一定程度可减轻 PD 小鼠焦虑行为。本实验发现，NaB 可显著减少多巴胺神经元丢失，这从病理层面验证了 NaB 的有效性。

综上所述，NaB 对 PD 有一定保护作用，它可通过减少多巴胺神经元缺失，进而改善对 PD 运动功能及部分非运动功能，这对今后 PD 的治疗提供了一定实验基础及治疗策略。但本研究有不足之处，虽然从行为学及病理学上进一步验证 NaB 对 PD 保护作用，但缺少具体发病机制研究，因 NaB 是一种去乙酰化酶抑制剂，今后研究将以表观遗传学为侧重点，通过对各组小鼠进行基因组测序，寻找相应信号通路，深入研究其发病机制。