李水霞 孙丽蓉 苏日娜 马显军 杜晓 张毅 刘飞飞

(内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院，内蒙古 包头 014000)

内皮祖细胞(EPCs)表面表达CD34+、CD133+、血管内皮生长因子(VEGF)受体等细胞分子，许多学者把同时表达CD34+、VEGF受体2(KDR)+、CD133+的细胞称作早期的功能性EPCs，但到目前为止，并没有直接的证据证明体外分离培养的外周血CD34+、KDR+、CD133+细胞能够直接分化为内皮细胞〔1，2〕。而单表达CD34+的EPCs在临床上具有独特的意义，称之为CD34+细胞，其主要存在于骨髓中，当机体在炎症、缺血、损伤及肿瘤等病理状态下，它可以从骨髓中动员进入外周循环血，再由外周循环血到达病变所在部位，增殖、分化为内皮细胞，修复血管及组织的损伤，对维持内皮功能正常起着十分重要的作用，较低水平的外周血CD34+细胞计数已报道在各种肺部疾病中，包括急性肺损伤〔3〕，间质性肺疾病〔4〕，稳定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。也有研究表明〔5〕，CD34+细胞水平降低与稳定型冠状动脉疾病(CAD)患者死亡风险增加有关，在CAD的急性事件期间，循环CD34+细胞的浓度在VEGF〔6〕和全身炎症〔7〕的影响下显著增加。到目前为止，CD34+细胞对COPD急性加重(AECOPD)恶化起到的作用尚未得到研究。本课题假设类似于CAD急性事件期间发生的情况，循环CD34+细胞的水平将在AECOPD期间增加，并探讨这些细胞的增加是否与内皮功能和全身炎症的改变有关，进一步探讨COPD与内皮细胞的潜在机制。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2016年10月至2017年10月内蒙古包头医学院第二附属医院呼吸科AECOPD患者35例，稳定COPD患者35例，10例肺功能正常的吸烟者和10例健康从不吸烟者。所有患者符合中华医学会2013年版《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》中制定的COPD的诊断标准，AECOPD患者的选取标准是至少在入选前3个月接受了抗胆碱能药，长效β2激动剂(LABA)和吸入皮质类固醇激素治疗。AECOPD患者的排除标准：合并有肺炎、肺栓塞、急性心脑血管疾病、肾功能不全、肝脏疾病、自身免疫疾病、任何来源的癌症和(或)所需的机械通气者。 COPD患者纳入标准是：①根据慢性阻塞性肺病全球倡议(GOLD)标准的COPD；②在纳入研究之前的12 w内未急性加重或治疗未变化而定义的临床稳定性；③至少在其包含前3个月用抗胆碱能药，LABA和吸入皮质类固醇治疗。 在研究期间未接受全身性类固醇，且未患有神经肌肉，风湿病和(或)不稳定的心及脑血管疾病，无吸烟史。

肺功能正常的吸烟者及肺功能正常的无吸烟者纳入标准：①>50岁；②久坐不动的生活方式；③正常的肺活量测定；④自愿参加这项研究。

1.2测量方法 测量均在入院的第一个24 h内进行，所有患者未接受过全身性皮质类固醇和(或)抗生素的治疗。对所有AECOPD患者的治疗标准化：包括①雾化支气管扩张剂(异丙托溴铵130 μg和福莫特罗2次/d)；②吸入糖皮质激素(布地耐德160 μg，2吸/次，2次/d)；③抗生素(头孢他啶2.0 g，2次/d，连续7 d或左氧氟沙星500 mg，2次/d，连续7 d)；④控制氧疗。 所有参与实验者全部在清晨空腹抽取肘静脉血5 ml到肝素抗凝管，于-20℃冰箱保存。

1.3CD34+细胞的检测 取4支TruCOUNT管，其中1支为测定管，另3支则为对照管，分别标记，均加入50 μl抗凝血，测定管中加入CD34-PE，CD45-PerCP各10 μl，对照管中加入IgG1-PE，CD45-PerCP各10 μl，充分混合均匀，室温下避光反应15 min。四支试管中分别加入红细胞裂解剂450 μl，充分混合均匀后，再次室温下避光反应15 min，24 h内用流式细胞仪进行分析。

流式细胞仪分析样本数据：流式细胞仪(BD公司)，开机后以荧光校准微球，自动校准软件设置仪器状态，包括荧光补偿、灵敏度等参数，之后进入ProCOUNT自动分析软件，对测定管和流式管进行检测，收集60 000个以上的有核细胞作为有效的信号，获取数据文件，自动分析其结果，测出CD34+细胞的绝对计数值，为了保证检测结果的准确性，以上步骤一般不超过24 h。

使用市售试剂盒(BioSource，比利时)通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定VEGF和C反应蛋白(CRP)的血浆水平。 测量进行2次，取平均值用于分析。

1.4肺功能 因AECOPD住院的患者，在出院时进行肺功能测定。 在入院时呼吸室内空气的所有AECOPD患者中获得动脉血气(IL BG3，Izasa，Spain)。所有受试者进行静息状态下肺功能的测定，采用JAEGER肺功能仪完成检测。所有受试者在检查前的48 h内未使用β受体激动剂、抗胆碱类药物、氨茶碱及糖皮质激素等药物，以免影响检查结果的准确性。主要检测指标为：用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1/FVC及FEV1占预计值的百分比(FEV1%)等肺功能指标，当吸入支气管舒张剂后，FEV1/FVC<70%可以确认为不完全可逆性气流受阻。

1.5统计学方法 采用SPSS20软件进行单向方差分析、Bonferroni检验、配对t检验、Spearman相关性检验。

2 结 果

2.1各组一般资料比较 各组年龄和体重指数(BMI)比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。AECOPD组、稳定COPD组、吸烟组心血管风险因素占比，差异均无统计学意义(P>0.05)，但3组均明显高于不吸烟组，差异有统计学意义(P<0.05)；AECOPD组、稳定COPD组FEV1、FEV1/FVC均明显低于吸烟组和不吸烟组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；AECOPD组、稳定COPD组氧分压(PO2)均明显低于吸烟组和不吸烟组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；各组二氧化碳分压(PCO2)比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组一般资料比较

2.2各组其他指标比较 各组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；AECOPD组、稳定COPD组和不吸烟组低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平均明显低于吸烟组，差异有统计学意义(P<0.05)；AECOPD组白细胞计数明显高于其余3组，且吸烟组白细胞计数明显高于不吸烟组，差异均有统计学意义(P<0.05)；AECOPD组中性粒细胞计数明显高于其余3组，且稳定COPD组和吸烟组中性粒细胞计数均明显高于不吸烟组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；AECOPD组CD34+水平明显高于稳定COPD组和吸烟组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；AECOPD组VEGF水平明显高于其余3组，且稳定COPD组明显高于不吸烟组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；AECOPD组CRP水平明显高于其余3组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组其他指标比较

2.3相关性分析 AECOPD组循环CD34+细胞水平与PaO2(r=-0.23，P=0.16)和FEV1(r=-0.20，P=0.40)之间无相关性；稳定COPD组循环CD34+细胞水平与PaO2(r=0.22，P=0.25)和FEV1(r=0.16，P=0.70)之间无相关性。AECOPD组VEGF水平与循环CD34+细胞水平之间存在正相关(r=0.35，P=0.040)，稳定COPD组中未发现有相关性(r=0.29，P=0.83)。AECOPD组和稳定COPD组心血管风险因素对VEGF水平无显著影响。AECOPD组(r=0.32，P=0.85)或稳定COPD组(r=0.304，P=0.76)循环CD34+细胞水平与CRP水平无相关性。 同样，AECOPD组(r=- 0.07，P=0.96)或稳定COPD组(r=0.19，P=0.25)循环中CRP和VEGF水平之间无相关性。

3 讨 论

目前认为COPD发生、发展的原因之一是肺血管内皮细胞损伤〔8〕。CD34+是参与内皮损伤修复的细胞，可向损伤内皮进行趋势，并定向分化为成熟的内皮细胞，加速损伤内皮的修复〔9～11〕。研究发现稳定期COPD患者外周循环CD34+细胞水平及功能下降，但关于稳定期COPD 患者外周血中 CD34+细胞水平减少的具体机制目前仍不是十分清楚，国外有学者推测可能与循环中的CD34+细胞在局部受损组织过度的积聚和被过度消耗有关〔12〕，也有学者推测与其自身的炎症反应有关，从而导致 CD34+细胞水平的降低〔13〕。本研究发现COPD急性加重期CD34+细胞水平显著增加，且与循环血管内皮因子数量之间存在明显正相关，与CRP水平无关。研究〔14，15〕表明除了VEGF可以引起内皮祖细胞的增高，全身炎症状态也可能促进内皮祖细胞的动员，CRP水平和循环内皮祖细胞数量之间存在明显的正相关。Heeschen等〔16〕报告了内皮祖细胞数量与血管内皮生长因子和促红细胞生成素之间的正相关，但与CRP水平无关。另外研究〔17〕发现COPD患者循环CD34+细胞水平的增高，可能与健康对照受试者的吸烟状况不匹配有关，本研究与年龄，性别和吸烟状况相匹配的对照组相比，COPD患者的CD34+细胞水平显著增高。排除诸多影响CD34+细胞水平的因素外，可能循环CD34+细胞水平的增高与VEGF水平上调有关。

总之，AECOPD患者的CD34+细胞水平显著高于稳定期的COPD患者、健康吸烟者和健康从不吸烟者。在AECOPD期间，循环CD34+细胞水平与VEGF水平正相关，表明AECOPD患者的CD34+细胞水平的增加，可能与VEGF的增高有关。这些观察的临床相关性需要未来大样本进一步研究。