盛莉 王琳 康延海 陈邓林 杨生辉 李向璐 李赛 孔灿灿 袁波

(海南省人民医院 海南医学院附属海南医院 1肿瘤内一科，海南 海口 570311；2心理科；3内镜诊疗中心；4胃肠外科)

结直肠癌发病率在我国老年人群恶性肿瘤中位居第三位，死亡率居第五位，是威胁老年人生命健康的主要疾病之一〔1〕。寻找有临床意义的分子用于结直肠癌的诊断及监测一直是学界关注的热点，近年来随着基因调控研究由编码基因深入到非编码基因水平，长链非编码RNA在结直肠癌中的作用逐渐被揭示，有望与传统肿瘤标志物协同从而提高老年结直肠癌的诊疗水平〔2〕。HAGLR是2017年首次发现的长链非编码RNA，其在食管癌、肝癌及结直肠癌细胞中均表现出促癌活性〔3～5〕，提示其在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，有成为肿瘤分子标志物的潜能，但有关其在老年结直肠癌患者中的临床意义尚未见报道。本研究拟分析HAGLR在老年结直肠癌患者组织中的表达及其与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年5月至2019年6月在海南省人民医院手术的患者组织样本215例(观察组)，同期选取年龄及性别与观察组匹配的患者100例，经结直肠镜活检结果为增生性息肉或炎性息肉，手术切除标本及活检组织标本均使用生理盐水冲洗后剪碎装入冻存管，置于-80℃冰箱冻存备用。回顾分析患者临床资料包括年龄、性别、肿瘤位置、大小、浸润深度、淋巴结转移、临床分期、肿瘤分化程度〔6〕及术前癌胚抗原(CEA)水平，采用电话随访或门诊复诊的方式，自手术当日起进行随访，截止时间为2020年6月30日，记录患者总生存时间(病理确诊日期至患者死亡或最后1次随访日期)和无复发生存时间(病理确诊日期至局部复发或远处转移或最后1次随访日期)〔7〕。本研究已报本院医学伦理委员会批准。对照组男72例，女28例；年龄64～75岁，平均(67.8±6.9)岁。观察组男144例，女71例；年龄61～77岁，平均(68.4±7.5)岁；肿瘤位置：结肠12例，直肠94例；肿瘤大小2.3～6.9 cm，平均(4.5±2.3)cm；浸润深度：T1 46例，T2 65例，T3 104例；淋巴结转移：N0 54例，N1 75例，N2 86例；临床分期：Ⅰ期66例，Ⅱ期37例，Ⅲ期112例；肿瘤分化程度：低分化71例，中分化77例，高分化67例。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：①术前活检及术后组织病理报告明确为普通管状腺癌；②接受结直肠癌根治手术且完整切除肿瘤(肿瘤浸润最深处与切缘软组织距离>1 mm)；③术前未接受放疗、化疗、靶向治疗和生物治疗等辅助治疗；④患者神志清楚且积极配合研究；⑤年龄>60岁。排除标准：①术前经CT或磁共振成像(MRI)证实出现远处转移；②特殊病理类型如印戒细胞癌、鳞癌、神经内分泌肿瘤等；③接受姑息性切除；④5年内有其他恶性肿瘤既往史者；⑤合并心、肝、肾等重要脏器严重功能不全者。

1.3Trizol法 提取总RNA 取100 mg组织加入1 ml Trizol(中国，上海，赛默飞世尔科技有限公司，货号15596026)，制备组织匀浆后转移至1.5 ml离心管，室温静置5 min后加入200 μl氯仿，颠倒混匀后室温静置5 min，4℃下12 377 r/min离心15 min，转移上层水相至新1.5 ml离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置10 min，4℃下12 377 r/min离心10 min，弃上清液，加入1 ml 75%乙醇4℃下9 790 r/min离心5 min清洗2次，弃乙醇留取沉淀，自然晾干10 min后20 μl 焦碳酸二乙酯水溶解沉淀。采用超微量分光光度计(中国，上海，赛默飞世尔科技有限公司，货号NanoDrop2000)测定总RNA浓度及纯度，合格RNA样品A260与A280比值为1.8～2.0。

1.4逆转录 cDNA合成根据步骤1.3中总RNA的浓度计算逆转录中所需模板RNA体积，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(中国，上海，赛默飞世尔科技有限公司，货号K1621)合成cDNA，逆转录体系：2 μg总RNA，1 μl逆转录引物，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，1 μl 200 U/μl逆转录酶，5 μl 5倍逆转录酶缓冲液，1 μl 20 U/μl RNA酶抑制剂，并用无RNA酶水将总反应体积补至20 μl。逆转录反应条件：25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min。

1.5实时荧光定量 PCR采用 TB Green®Fast qPCR Mix(中国，北京，宝日医生物技术有限公司，货号RR430S)进行实时荧光定量PCR。PCR体系：10 μl 2×TB Green Fast qPCR Mix，上下游10 μmol/L引物各0.8 μl，0.4 μl 50×ROX，2 μl模板cDNA，6 μl灭菌水。使用7500HT快速实时荧光定量PCR系统(中国，上海，赛默飞世尔科技有限公司，货号4351107)进行PCR。以GADPH作为内参。PCR反应条件：95℃ 30 s预变性后，95℃ 3 s，60℃ 15 s，40个循环，反应结束后设置熔解曲线分析程序。 所用引物序列如下：HAGLR上游引物5′-GGCTCTTCCCTAATGTGTGG-3′，下游引物5′-CAGGTCCAGCATGAAACAGA-3′；内参GAPDH上游引物5′-GACTCATGACCACAAGTCCATGC-3′，下游引物5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。每反应设置3个复孔，根据各孔获得的循环阈值(CT)进行统计结果分析，采用2-ΔΔCT法分析基因表达水平，相对表达的倍数 N=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT =ΔCT实验-ΔCT对照组，ΔCT实验/对照=CT目的基因-CT内参。

1.6统计学分析 使用SPSS19.0 软件进行t检验、χ2检验；使用受试者工作特征(ROC)曲线评估诊断效能；术后生存率用Kaplan-Meier检验，曲线差异用对数秩分析，生存率用寿命表法计算。

2 结 果

2.1HAGLR对结直肠癌的诊断效能 观察组HAGLR表达量及术前CEA水平〔(7.1±5.0)ng/ml〕高于对照组〔(0.6±0.2),(4.2±1.9)ng/ml〕，差异有统计学意义 (P<0.001)，HAGLR对结直肠癌诊断的曲线下面积(AUC)值〔0.890(95%CI0.851～0.923)〕高于CEA〔0.718(95%CI0.665～0.767)〕，差异有统计学意义(P<0.001)，见图1。根据ROC曲线确定HAGLR和CEA最佳灵敏度和特异度下截断值分别为0.86和7.37 ng/ml。HAGLR诊断结直肠癌的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及正确指数分别为73.5%、91.0%、94.6%、61.5%、0.64；CEA对诊断结直肠癌分别为52.6%、94.0%、95.0%、48.0%、0.47。

图1 HAGLR诊断结直肠癌的ROC曲线

2.2HAGLR与患者临床病理特征的关系 根据HAGLR表达水平将患者分为高表达组(HAGLR表达>0.86)128例及低表达组(HAGLR表达≤0.86)87例。高表达组男性比例、淋巴结转移数、临床分期及术前CEA水平均高于低表达组，肿瘤分化程度低于低表达组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.001)，见表1。

表1 HAGLR与患者临床病理特征的关系(n)

2.3HAGLR与患者预后的关系 至随访截止日期共失访18例(8.4%)，其中高表达组10例(7.8)，低表达组8例(9.2%)，随访时间12.0～28.5个月，中位随访时间15.2个月，全队列总生存率为81.7%，总生存时间为(23.4±2.7)个月(95%CI：20.5～26.3个月)，其中低表达组为89.8%；高表达组总生存率为73.7%，低表达组总生存时间为(25.0±2.5)个月(95%CI：22.4～28.7个月)，高于高表达组的(22.6±3.4)个月(95%CI：18.9～25.3个月)，差异有统计学意义(P=0.001)；无复发生存率为70.1%，无复发生存时间为(22.1±1.9)个月(95%CI：20.6～24.3个月)，其中低表达组无复发生存率为83.7%，高表达组为56.6%；低表达组无复发生存时间为(24.7±2.2)个月(95%CI：22.1～26.7个月)，高于高表达组的(20.3±2.1)个月(95%CI：17.5～23.9个月)，差异有统计学意义(P=0.017)。

3 讨 论

近年来多种长链非编码RNA分子被发现与结直肠癌的病理特征及预后相关，有助于弥补过去CEA诊断敏感性及预后预测效能较差的缺陷〔8～10〕。本研究结果显示肿瘤患者组织中HAGLR的表达量及术前CEA水平均升高，进一步诊断试验发现CEA对结直肠癌诊断的特异度较高而灵敏度欠佳，与既往研究结论相符，Peng等〔11〕研究中CEA诊断结直肠癌的特异度和敏感度分别为93.6%和45.6%，略低于本研究，其原因可能在于Peng等〔11〕的研究对象年龄范围为27～97岁，本研究仅纳入了60岁以上的老年患者。HAGLR在与CEA诊断特异度相当的基础上表现出更高的灵敏度，诊断效能高于CEA。

以往细胞动物实验研究也证实了HAGLR可促进肝癌细胞的恶性转化〔4〕，也有研究报道HAGLR在肺腺癌细胞中表现为抑癌表型，提示HAGLR可能在不同肿瘤类型中发挥着不同的功能，有待进一步深入探讨〔12〕，而其与肿瘤浸润深度及肿瘤部位并未见显著关联，说明HAGLR可能更倾向于影响肿瘤的分化及转移而不是其增殖能力。本研究还发现高表达组男性比例更高，其机制尚不明确，推测这可能与其编码基因所在染色体与Y染色体之间的连锁有关。

本研究存在以下几点不足：①由于结直肠癌术后辅助治疗方案取决于患者基因多态性且情况复杂，因此本研究未纳入术后辅助放化疗情况，后续研究有必要将其纳入亚组分析〔13〕；②本研究使用组织样本而不是外周血检测HAGLR的表达，这主要在于目前技术水平的不足限制了外周血长链非编码RNA的检出率，有赖于未来基础科研的进步提高HAGLR临床应用价值〔14，15〕。