杨世荣

(青海省第五人民医院，青海 西宁 810000)

胃癌早期发病并展开手术治疗预后良好，5年生存率可达到90.0%以上，然而当疾病确诊时，多已进入晚期，治疗难度增加〔1〕。晚期胃癌与胃黏膜的增生性病变有紧密联系性，如何对二者进行准确鉴别已经成为近年来胃黏膜病理诊断的一个重难点问题〔2〕。当前，在晚期胃癌、胃黏膜增生性病变的鉴别诊断中免疫组织化学技术广泛被应用。存活蛋白(Survivin)、磷酸酯酶抑制基因(PTEN)、肠道特异性转录因子(cdx2)三个免疫组织化学指标在晚期胃癌、胃黏膜增生性病变预后判断中的价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 2016年7月至2017年8月于青海省第五人民医院接受诊治的老年晚期胃癌患者中选43例，设为胃癌组，男23例，女20例，年龄61～72岁，平均(66.2±4.5)岁；于同期在青海省第五亿医院接受诊治的胃黏膜增生性病变患者中选46例，设为黏膜组，男24例，女22例，年龄61～76岁，平均(67.1±3.7)岁；选择胃黏膜正常者45名设为健康组，男23例，女22例，年龄60～73岁，平均(66.1±6.4)岁。纳入标准：①胃癌组、黏膜组经《WHO肿瘤病理学及遗传学分类·消化系统肿瘤》〔3〕中的诊断标准确诊为晚期胃癌、胃黏膜增生性病变，健康组明确胃黏膜无上诉或其他病变；②胃癌组有完整的外科切除标本，黏膜组、健康组有完整的胃镜活检标本；③对研究知晓并配合对知情同意书进行签署者；④得到医院医学伦理会知情同意者。排除标准：①不符合纳入标准者；②接受过放化疗者；③接受过免疫治疗者。3组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1试剂与设备 Elivision TM plus试剂盒及枸橼酸缓冲液均购于迈新生物技术开发有限公司，枸橼酸缓冲液编号为MVS-0100；磷酸缓冲盐溶液、盐酸酒精自主配置；乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液购于迈新生物技术开发有限公司，编号MVS-0075；过氧化氢溶液购于广东恒健制药有限公司，国药准字H44023919；非免疫性羊血清购于迈新生物技术开发有限公司，编号MAB-036；电热恒温培养箱购于山东潍坊医疗器械厂，型号为420；微波炉购于上海松下微波炉有限公司，型号NN-Y21WF；冰箱购于河南新飞电器有限公司，型号BCD-215D；光学显微镜购于OLYMPUS，型号BX50；石蜡切片机购于LEIKA，型号RM2135；高压锅、电磁炉均购于美的电器公司。

1.2.2检测方法 三组均通过Elivision TM plus法(免疫组织化学法)展开Survivin、PTEN、cdx2检测，依据各抗体不同需求，对组织抗原进行修复处理。(1)Survivin、cdx2选择柠檬酸缓冲液高温高压抗原法展开测定：①以柠檬酸缓冲液实施加热，组织切片以二甲苯脱蜡、梯度酒精进行水化处理，在蒸馏水中浸泡，待用。②在高压锅中置入1 500 ml柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，大火加热，沸腾后，置入脱蜡水化处理后的组织切片，将锅盖盖上，加热，喷气后，计时15 min，取下高压锅，冷却到室温状态，将切片取出，以蒸馏水进行2次冲洗，再用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2～7.4)进行2次冲洗，一次持续3 min。(2)PTEN应用EDTA加热水浴抗原修复法展开测定：①对组织进行脱蜡水化处理，用蒸馏水进行2次冲洗，取EDTA抗原修复液50 ml，依据1∶5进行稀释，提取500 ml工作液在烧杯(1 000 ml)中置入，得到500 ml工作液，在1 000 ml的烧杯中置入，加热到沸腾状态，缓慢地将组织切片置入其中，使切片被修复液充分浸泡，继续进行20 min的加热，冷却至室温状态，将切片取出，通过蒸馏水进行1次冲洗，再用PBS进行2次冲洗。②于每张切片中加入0.3%过氧化氢溶液50 ml，于室温下进行10 min的孵育，以达到对过氧化物酶活性进行阻断的目的。③取出切片，通过PBS进行3次冲洗，去除PBS，于每张切片上滴加非免疫性羊血清50 μl，于室温下进行10 min的孵育。④将血清去除，于每张切片上滴加第一抗体50 μl，放入湿盒中，在4℃冰箱中保存过夜，取出切片，通过PBS进行3次冲洗，甩干。⑤将50 μl对应第一抗体相应生物素标记的第二抗体滴加在每片切片上，置入37℃温箱中，进行40 min的孵育，用PBS进行3次冲洗，去除PBS，每张切片上加过氧化酶溶液50 μl，置入37℃的恒温箱中进行30 min孵育，用PBS实施3次冲洗。⑥将PBS液去除，每张切片上加二氨基联苯胺(DAB) 100 μl，于显微镜下观察3～10 min，依据阳性、阴性情况及时将反应终止。⑦用自来水冲洗，通过苏木素进行复染处理，再用盐酸酒精(1%)实施分化处理，用自来水冲洗，再以PBS行返蓝处理，采用DAB实施显色处理，用梯度酒精展开脱水干燥处理，经二甲苯透明，用中性的树胶封固。

1.3结果判定方法 Survivin是胞质着色，PTEN是胞核、胞质都着色，cdx2是胞核着色，若着色处有棕黄色的颗粒状物质，则为阳性结果〔4〕。其中，弱阳性：5%<且≤25%，中等阳性：25%<且≤75%，强阳性：>75%〔5〕。

1.4数据分析 采用SPSS20.0软件t、χ2检验。

2 结 果

2.1晚期胃癌、胃黏膜增生性病变、正常胃黏膜组织中Survivin的表达情况 正常胃黏膜组织中未见阳性细胞；在不完全大肠型化生胃黏膜组织(15例)中，仅2例患者可见弱阳性表达，阳性率是13.33%(2/15)；在低级别上皮瘤变的胃黏膜组织(13例)中，5例患者可见中度阳性表达，阳性率是38.46%(5/13)，1例为弱阳性表达；在高级别的上皮内瘤变胃黏膜组织(18例)中，12例可见阳性表达，阳性率为66.67%(12/18)，2例为弱阳性，8例为中度阳性，2例为强阳性，见图1；43例晚期胃癌患者29例可见阳性表达，阳性率是67.44%(29/43)，12例为弱阳性，9例为中度阳性，8例为强阳性，见图2。

图1 胃黏膜组织survivin表达(DAB，×400)

2.2PTEN在晚期胃癌、胃黏膜增生性病变、正常胃黏膜组织中的表达情况 正常胃黏膜中，PTEN均呈阳性表达；15例不完全大肠化生中，13例可见阳性表达(86.67%)，其中，弱阳性有8例，中度阳性有3例，强阳性有2例；13例低级别上皮内瘤变中，8例(61.54%)可见阳性表达，其中，弱阳性有4例，中度阳性有3例，强阳性有1例；18例高级别上皮内瘤变中，9例(50.00%)可见阳性表达，其中，5例为弱阳性，3例为中度阳性，1例为强阳性；43例晚期胃癌中，13例(30.23%)可见阳性表达，见图3。其中，5例为弱阳性表达，7例为中度阳性表达，1例为强阳性表达。

图3 晚期胃癌中PTEN的阳性表达(DAB，×400)

2.3cdx2晚期胃癌、胃黏膜增生性病变、正常胃黏膜组织的表达情况 正常胃黏膜中cdx2未见表达；15例不完全大肠型化生中，11例(73.33%)可见阳性表达，2例为弱阳性，8例为中度阳性，1例为强阳性；13例低级别上皮内瘤中，3例(23.08%)可见阳性表达，均为弱阳性，见图4；18例高级别上皮内瘤中，10例可见阳性表达，阳性率为55.56%(10/18)，2例为强阳性，8例为中度阳性，见图5；43例晚期胃癌中，30例可见阳性表达，阳性率为69.77%(30/43)4例为弱阳性，23例为中度阳性，3例为强阳性，见图6。

图4 低级别上皮内瘤cdx2表达(DAB，×400)

图5 高级别上皮内瘤cdx2表达(DAB，×400)

图6 晚期胃癌中cdx2表达(DAB，×400)

2.4三组Survivin、PTEN、cdx2表达情况对比 胃癌组Survivin、cdx2阳性率明显高于黏膜组、健康组，PTEN阳性率明显低于黏膜组、健康组(均P<0.05)；黏膜组Survivin、cdx2阳性率明显高于健康组(P<0.05)，两组PTEN阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。在晚期胃癌患者中，Survivin阳性表达与cdx2呈正相关关系，与PTEN则呈负相关关系，见表2。

表1 三组Survivin、PTEN、cdx2表达〔n(%)〕

表2 三个指标在晚期胃癌患者表达的相关性(n)

1)胃癌组与黏膜组对比；2)胃癌组与健康组对比；3)黏膜组与健康组对比

3 讨 论

胃癌是常见消化系统恶性肿瘤的一种，对于此肿瘤，及早确诊并及时展开手术治疗是延长患者生存期限的关键。晚期胃癌指的是肿瘤发生于胃黏膜内、胃黏膜下，淋巴结转移尚未出现的胃部肿瘤，一般可分为隆起型、表面型、凹陷型几种〔6，7〕。但晚期胃癌与胃黏膜增生性病变有一定相似性，联系性也较为紧密，如何准确鉴别二者是晚期胃癌诊断的难点问题之一〔8，9〕。

胃黏膜增生指的是胃黏膜腺体干细胞发生的增生性病变的疾病，一般而言，胃黏膜增生性病变主要有以下几个类型：(1)无不典型增生。此类型又包括以下几种：①正常。即黏膜隐窝、固有的腺体、腺颈部、间质位置完好，炎性浸润轻度或不可见〔10，11〕。②反应性隐窝增生。即单纯性增生，一般于消化性溃疡、胃炎处发生。③肠化生，主要包括小肠型、不完全型两种。(2)不确定的不典型增生。可见弯曲细长的腺体结构，细胞核会被覆盖，使黏液分泌减少甚至停止〔12〕。(3)胃黏膜上皮非典型增生。主要有低级别、高级别上皮内瘤变两种。(4)黏膜内癌。即仅黏膜层受到癌组织的浸润〔13〕。

Survivin是凋亡抑制蛋白的一种，于1997年被发现，其中含有氨基酸142个，分子量是16.5 kD，在人类多数肿瘤细胞中均可见表达，在正常人中，一般仅在睾丸、分泌期的子宫内膜、胸腺中表达〔14，15〕。此蛋白可对肿瘤细胞的凋亡产生抑制性作用，使肿瘤细胞增殖。资料显示〔16〕，Survivin会对肿瘤化疗药物的敏感性产生影响。正常胃黏膜-增生性病变-晚期癌细胞这一转换过程中，Survivin表达也发生着进行性的改变，低级别上皮内瘤变中，Survivin阳性细胞较正常胃黏膜多，且阳性细胞排列不具连续性；在高级别的上皮内瘤变、晚期胃癌中，Survivin阳性细胞可见弥漫性的表达。此结果表明，对于增生性病变的胃黏膜，若可见较高的Survivin阳性率，且阳性细胞分布有连续性，则可能发生了晚期胃癌改变。提示，增生性胃黏膜病变可见高表达的Survivin，则预后较差，需进一步展开确诊是否为晚期胃癌病变，并及时予以干预，以使患者预后得以改善。

PTEN在维持细胞增殖、分化、凋亡中有重要作用，可使肿瘤细胞对凋亡刺激更为敏感，诱导凋亡出现〔17，18〕。本研究提示，对于Survivin阳性较高、PTEN阳性率较高的增生性胃黏膜病变，预后较差，需考虑是否已经发生晚期胃癌或癌前病变。

cdx2 是人体肠道中的一种特异性转录因子，在维护肠胃细胞正常形态中意义重大〔19〕。本研究结果提示，cdx2是胃黏膜上皮化生的一个特异性标志物，且在肠上皮化生到胃癌的发展过程中，cdx2均可发挥一定作用。因此，对晚期胃癌进行鉴别诊断时，应积极展开此指标的检测，依据其水平判断患者预后情况，以便于施予针对性干预。

本研究结果还提示，在晚期胃癌、胃黏膜增生性病变中，Survivin、PTEN、cdx2表达有差异性，可将其视作晚期胃癌、胃黏膜增生性病变的鉴别诊断指标。另外，在晚期胃癌的发生、发展过程中，Survivin、PTEN、cdx2发挥的作用存在差异性，作用机制不同，但其之间存在相关性，Survivin、cdx2过度表达，PTEN低表达可作为晚期胃癌预后差的预测指标。

综上，对晚期胃癌、胃黏膜增生性病变进行诊断时，可积极展开Survivin、PTEN、cdx2检测，并以此为依据判断预后，有助于促进患者预后质量的改善。