王 丹，马奔卉，李 聪，李 超

(吉林大学第一医院 1.麻醉科；2.二部手术室，吉林 长春130021)

促进炎症的消退是治疗炎症性肺部疾病的关键。长期以来，人们采取种种措施抗感染，清除病原菌，然而随着各种抗生素的大量应用，耐药细菌增多，肺部炎症迁延不愈。Rachel等人[1]发现过表达USP14使去泛素化和降解IκB增多，通过直接调节NF-κB·IκB通路，促进细胞因子的释放，然而抑制USP14的表达，是否抑制炎性因子的释放尚不明确。本研究通过下调USP14的表达，抑制LPS或者TNF-α所诱导产生炎性因子的释放，包括白细胞介素-6(IL-6)或者角化细胞源性细胞因子(KC)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，减轻炎症反应的程度，报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞培养鼠肺上皮细胞(MLE12)(ATCC,Manassas,VA)是在含有氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、雌激素、硒、10%小牛血清及抗生素的培养基里，在37℃含有5% CO2的温箱里孵育。细胞传代：细胞在培养箱中培养48-72 h后，待细胞融合度达到80%-90%开始传代。取出细胞，弃去培养基，PBS洗一遍，去除血清和漂浮的细胞，弃去PBS。加入3 ml Trypsin-EDTA(0.25%)，消化约3 min，用移液枪吹打培养皿底部，迅速加5 ml培养液终止消化。收集细胞悬浮液于15 mL离心管中，离心，1 000 rpm×3 min，弃上清，加入新鲜DMEM培养基重新悬浮细胞，将细胞重新分置于培养皿中放入温箱培养。

1.2 质粒转染将6 μg质粒和18 μL的SuperFect转染试剂与Opti-MEM培养液混匀，放置10 min后，加入到细胞融合度达到60%-70%的10 cm培养皿中，放置温箱中培养48 h。 按照试剂说明书使用Lipofectamine-3000进行siRNA的转染72 h。

1.3 Western Blot检测蛋白制备蛋白样品：细胞按需处理后，提取细胞蛋白。培养箱中取出细胞，弃掉培养液，PBS洗涤细胞2次，弃去PBS，加入适量的细胞裂解液，冰上裂解5 min。用干净的细胞刷刮取培养皿底部的细胞，收集细胞裂解产物于1.5 mL标记好的EP管中后，在冰上进行超声波裂解，裂解3次，4℃离心，12 000 rpm×3 min，收集上清即为细胞总蛋白。准备好蛋白标准品、蛋白样品，采用BCA法测蛋白浓度。电泳：取两块SDS-PAGE凝胶板，装在电泳架上，对应正负极后，放入电泳槽内，加入电泳液，检查有无漏液。垂直拔出梳子，用枪吸去内槽的气泡以便上样。连接正负极进行电泳，跑至marker所有条带出现并接近玻板下缘停止电泳。转膜：电泳结束后，取出玻璃板，薄玻片在下，用撬板小心沿厚玻板撬开，切去浓缩胶，依次放上黑海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸和白海绵，整体放在转膜夹上，放入转膜槽中，注意电极方向，加入转膜液，插上电极进行转膜。封闭：转膜结束后，将PVDF膜转移到封闭盒中，TBST冲洗液冲洗后加入封闭液，放置摇床上，室温封闭1 h。孵育抗体：弃掉封闭液，用TBST冲洗2遍，将配制好的一抗浸没PVDF膜，放置摇床上，4℃孵育过夜。次日回收一抗，TBST洗膜3次，加入稀释好的二抗浸没PVDF膜，水平摇床1 h。显影：回收二抗，TBST洗膜1次，进行曝光显影。

1.4 ELISA法检测促炎因子将MLE12细胞取出，接种于6孔板上，显微镜下观察待细胞密度长到60%-70%后按上述转染步骤进行转染。不同的实验分为不同的组别，用LPS(20 μg/mL)或TNF-α(10 ng/mL)处理4 h后，分别收集细胞培养上清至EP管中，4℃离心，吸取上清液。按白细胞介素6(IL-6)、KC、TNF-α的ELISA使用说明书进行操作。从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30 min，取酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准孔和样本孔。记录各孔位置，在标准孔中加入标准品50 μL，待测样本孔中先加入待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL，盖上封板膜室温孵育1 h。弃去液体，吸水纸上拍干，加入洗涤液重复洗板3次。每孔加入酶标工作液50 μL，室温孵育1 h。重复洗板3次。然后进行显色，每孔先加入显色剂A液50 μL，再加入显色剂B液50 μL，混匀后，37℃避光显色15 min。每孔加入终止液50 μL，终止反应。测定各孔的吸光值(OD值)，最后根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品的浓度，最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

1.5 试剂HA 抗体来源于 invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA)。脂多糖(LPS)来源于 Sigma 公司(St.Louis,MO)。TNF-α来源于Mabtech 公司(AmyJet Scientific Inc)。白细胞介素6(IL-6)、KC、TNF-α的ELISA试剂盒均来自于Abcam公司。USP14的小干扰RNA(siRNA)，β-actin抗体均来源于Sigma公司。USP14 抗体来源于Santa Cruz 生物科技公司(Santa Cruz,CA)。HA-USP14 质粒是由Wade Harper(Harvard Medical School)友情赠予。SuperFect转染试剂和Lipofectamine-3000转染试剂来源于QIAGEN公司(Hilden,GERMANY)。

1.6 统计学分析采用SPSS16.0软件对数据进行统计学处理。所有结果采用单因素方差分析进行处理，数据采用均数±标准差表示，数据来源于3次以上独立实验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达USP14减少IκB的表达并且显著增加LPS或TNF-α所诱导产生的炎症因子IL-6的释放NF-κB信号通路在炎症性信号通路中起着重要的作用，调节包括细胞因子和趋化因子等炎性因子的表达。为了研究USP14在炎症肺部疾病中的作用，我们在小鼠肺上皮细胞(MLE12)中过表达带有被HA标记的USP14(USP14-HA)质粒48 h，并且用LPS (20 μg/mL)或者TNF-α(10 ng/mL)刺激 4 h后，对细胞裂解液进行Western Blot分析，发现过表达USP14-HA减少IκB的表达，并不减少β-actin的表达(如图1A所示)。同时，收集细胞上清液进行ELISA分析，结果显示过表达USP14显著增加LPS或者TNF-α所诱导产生的炎性细胞因子IL-6的释放(如图1B所示)。

图1 过表达USP14对IκB蛋白水平的表达及炎性细胞因子IL-6的释放的影响

2.2 抑制USP14的表达显著减少LPS或TNF-α所诱导产生的炎性因子IL-6的释放在MLE12细胞中，用Usp14 siRNA转染肺上皮细胞进行基因敲除72 h，并且用LPS (20 μg/mL)或者TNF-α (10 ng/mL)刺激 4 h后，对细胞裂解液进行Western Blot分析，发现USP14的表达显著被抑制(如图2A所示)。为了进一步研究抑制USP14对炎性因子的影响。同时，收集细胞上清液进行ELISA分析，结果显示减少USP14的表达后显著抑制了LPS或者TNF-α所诱导产生的炎性细胞因子IL-6的释放(如图2B所示)。

图2 抑制USP14的表达对炎性因子IL-6释放的影响

2.3 USP14的特异性小分子抑制剂IU1显著抑制LPS或者TNF-α所引起的炎症反应为了进一步研究USP14对炎症反应的影响，USP14的特异性小分子抑制剂IU1(100 μM/mL)预处理16 h后，用LPS (20 μg/ml)或者TNF-α (10 ng/mL)刺激 4 h，收取上清液，ELISA结果显示IU1显著抑制了LPS或者TNF-α所诱导产生的促炎因子IL-6的释放(如图3A所示)。同样地，IU1预处理16 h后用LPS (20 μg/mL)刺激4 h后，ELISA结果显示IU1显著的抑制了炎性因子KC和TNF-α的释放(如图3B、3C所示)。

图3 IU1抑制LPS或者TNF-α所引起的炎症反应

3 讨论

炎症性肺部疾病是最常见的呼吸系统感染性疾病，其在世界范围内具有发病率高，死亡率高的特点。尽管对肺炎的防治已有安全有效的抗生素和疫苗，肺炎仍是全球第三大死亡原因及美国第六大死亡原因[2-3]。细菌内毒素(LPS)进入血液循环，结合细胞表面的模式识别受体(PRRs)，主要激活NF-κB和MAPK通路，以巨噬细胞和中性粒细胞为代表的炎症细胞过度激活，导致炎症介质过度释放，大量的促炎介质参与肺部的炎症反应，造成肺泡上皮细胞、血管内皮细胞及肺泡间质细胞的损伤，导致炎症反应放大和失控，进而造成肺脏的严重损伤[4]。为此，初期所采取各种抗感染和清除病原菌的措施，取得了较好效果。近年来，由于抗生素的广泛和大量使用，耐药细菌越来越多，大量使用抗生素不但没有控制炎症的进展，同时减弱了机体的免疫防御能力，使肺部炎症迁延不愈，组织损伤进一步加重[5]。虽然肺炎并非不治之症，但大量肺炎患者接受抗生素治疗效果欠佳甚至无效，致使病情加剧而导致预后不良。因此对肺炎的发病机制、及时控制肺炎炎性反应所带来的不良预后以及非抗生素类药物对肺炎的治疗作用的进一步探讨，具有非常重要的意义。

NF-κB是以p65和p50组成的异二聚体形式存在于细胞内的转录因子，参与多种炎性细胞因子的转录和调控[6-7]。在静息状态下，内源性抑制蛋白IκB-α与P65/ P50二聚体存在于细胞质中，使NF-κB核定位信号呈非活性状，从而抑制NF-κB移位至细胞核内与相应的DNA序列结合[8]。当上游信号脂多糖(LPS)或者肿瘤坏死因子(TNF-α)激活IκB激酶(IKK)后，活化的IKK会降解IκBα，使得P65/ P50两个亚单位活化并转移至细胞核内，与相应的炎性基因相结合，启动IL-6，KC，TNF-α等炎性相关基因的转录和表达，进而导致促炎因子的失衡，诱发炎症反应[9]。

泛素-蛋白酶体系统(UPS)是细胞内依赖ATP的蛋白质选择性降解系统，主要降解细胞内80%-90%泛素化的蛋白质(包括错误折叠、氧化和受损蛋白质)成为小的多肽，进而调节炎症、信号转导、抗原提呈、免疫应答等多种生物功能,与疾病的发生发展关系密切[10]。UPS中的26S蛋白酶体是由桶状的20S核心颗粒、一或两个19S调节颗粒和位于19S上的三种去泛素化酶组成，包括Ppn11，Uch37及USP14[11-12]。去泛素化酶分解底物上的泛素链进而调节蛋白的稳定性。泛素特异性蛋白酶 14(USP14)属于半胱氨酸水解酶，是泛素特异性蛋白酶家族(USPs)中唯一一个位于19S蛋白酶体上的去泛素化酶[13]，调节蛋白酶体的活性[14]。越来越多的证据表明，USP14调节各种生物反应，包括神经功能、趋化因子信号和肿瘤的发生[15-17]。最近Rachel K Mialki等人研究发现，USP14通过去泛素化作用调节NF-κB·IκB通路，促进细胞因子的释放，在炎症反应中起到重要作用[1]。另外，有研究报道称抑制USP14可以减少组蛋白乙酰转移酶(CBP)蛋白的数量进而降低LPS诱导肺上皮细胞中组蛋白的乙酰化水平，最终减少细胞因子的释放[18]。USP14小分子抑制剂IU1通过减轻肺内炎症反应可以显著降低鼠肺机械通气后的肺损伤[19]。另有研究发现，USP14通过增加细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化水平，进一步激活NF-κB·IκB通路来调节LPS诱导的炎症[20]。为了进一步研究USP14对炎症反应的调节作用，本研究采用脂质体Lipofectamine-3000转染USP14siRNA敲除USP14，阻断USP14的去泛素化作用，Westernblot结果表明，与阴性对照组比较，USP14siRNA组USP14蛋白的表达明显下调，获得较好的敲低效率，并显著抑制了LPS所诱导产生的炎症反应。同样地，采用IU1抑制USP14的活性后显著抑制LPS所诱导产生的促炎细胞因子IL-6、KC和TNF-α的释放。与之前的研究相似，我们过表达USP14显著减少IκB的表达，并且显著促进LPS所诱导产生的IL-6的释放。因此，我们发现下调USP14的表达，抑制LPS或者TNF-α所诱导产生炎性因子的释放，包括白细胞介素-6(IL-6)或者角化细胞源性细胞因子(KC)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，减轻炎症反应的程度。另外，IU1抑制USP14活性或敲低USP14，IκB的表达是否增加以及USP14对IκB的分子调节机制有待我们进一步研究。

有研究报道IU1通过减轻肺内炎症反应可以显著降低鼠肺机械通气后的肺损伤[19]，本研究接下来将收集临床上长期进行机械通气的并且需要肺泡灌洗的患者的肺泡灌洗液中炎性反应细胞，对其进行IU1处理，观察其炎性反应变化程度确定IU1的抗炎作用。