王慧香，徐孟宇，余 晖，许 涛，李 岳

(首都医科大学附属北京同仁医院 妇产科，北京100730)

宫颈鳞状上皮内病变(squamous intraepithelial lesion,SIL)是宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma,SCC)癌前病变，准确识别、精准治疗高级别宫颈鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)是SCC防治重点。临床病理诊断工作中，老年性宫颈萎缩性改变、鳞状上皮化生及鳞状上皮良性增生与SIL的鉴别常存在一定的困难，SIL的级别判定缺少客观依据。研究表明，高级别宫颈鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)诊断中，不同病理学家诊断一致性只有27.6%[1]。因此迫切需要寻找一些与诊断不同级别宫颈病变相关的、可靠的生物学标志物。

P16作为一种抑癌基因直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，一旦失活则会导致细胞恶性增殖，P16基因以缺失、突变方式广泛参与肿瘤形成[2],P16的表达与宫颈高度病变、宫颈癌等具有重要关联性[3]。Ki-67是一种细胞增殖标记物，作为核增殖抗体可用于肿瘤和反应性增生病变的鉴别。Ki-67表达于G0期以外处于其他细胞周期的细胞，可判断细胞的增殖活性，是确定良、恶性组织生长状态的重要标记物。郭晓宁等报道[4]，P16和Ki-67在SCC、HSIL、LSIL组中表达明显高于宫颈炎组，在SCC和HSIL组表达明显高于LSIL组。但仍有一些病例虽为HSIL，但不表达P16和Ki-67[5]。抑癌基因P53受到致癌因子攻击发生突变后，不但丧失正常功能，还有致癌作用。研究发现，许多肿瘤在癌前病变期和肿瘤早期存在P53基因突变[6-7]。本文拟探讨p16、Ki-67、P53蛋白在不同级别SIL中的表达情况及其相关性，提高HSIL准确诊断率。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2015年3月-2018年3月首都医科大学附属北京同仁医院阴道镜直视下宫颈活检病理标本共180例为研究对象，依据常规HE染色病理切片，病理诊断经2名经验丰富病理科医师分别阅片后共同确诊。依据《2014年第四版女性生殖器官肿瘤WHO分类》诊断标准，根据病理组织学诊断结果分为HSIL组60例，LSIL组60例；选取60例宫颈炎病例作为对照组。入组病人年龄在22-64岁，平均42.5岁，各组病人年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 排除标准① 妊娠期和哺乳期女性；② 患有自身免疫性疾病；③患有其他恶性肿瘤；④既往有子宫切除术病人。

1.3 检测方法所有标本经4%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，3-4 μm连续切片，分别进行HE染色和SP法免疫组化染色封片。以PBS溶液代替一抗作为阴性对照。浓缩型鼠抗人P16单克隆抗体、Ki-67单克隆抗体及P53抗体均购自美国Abcam公司。

1.4 结果判定在病理显微镜下，浏览整个切片后，选择病变最典型、阳性表达最强的部位，尽可能包含上皮层和基底层。参照Shi和Pinto等半定量评价标准：① P16以细胞核和/或细胞质着棕黄色颗粒为阳性，无者为(-)；棕黄色颗粒为(+)，棕黄色粗颗粒为(++)，棕褐色粗颗粒为(+++)。② P53和Ki-67以细胞核出现明显的棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞仅位于基底层及副基底层，阳性细胞百分率=阳性细胞数/计数细胞数。阳性细胞数≤5%为(-),6%-25%为(+),26%-50%为(++),50%-75%为(+++)，>75%为(++++)。本研究以阳性强度在(+)以上者列为阳性表达；(-)为0分，(+)为1分，(++)为2分，(+++)为3分。也可以采用阳性细胞在鳞状上皮垂直面分布比例标记，基底及基底旁细胞阳性为(+)，下1/3以内细胞着色为(++)，1/3-2/3细胞着色为(+++)，超过下2/3细胞着色为(++++)。本研究以阳性强度在(+)以上者列为阳性表达；(-)为0分，(+)为1分，(++)为2分，(+++)为3分，(++++)为4分。

1.5 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料采用“均数±标准差”表示，阳性率组间比较采用卡方检验或者确切概率法，使用灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标评价诊断试验效能，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p16在不同级别宫颈病变中的表达在宫颈鳞状上皮细胞核/浆内出现棕黄色颗粒判定为p16表达阳性。在宫颈炎组、LSIL组、HSIL组中p16的阳性表达率随宫颈病变级别的升高呈上升趋势，三组间表达差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 p16在不同级别宫颈病变中的表达情况

2.2 Ki-67在不同级别宫颈病变中的表达Ki-67主要表达于宫颈鳞状上皮细胞核，为棕黄颗粒状沉积。不表达或“+”表达均判定为阴性。Ki-67在宫颈炎组、LSIL组、HSIL组间表达阳性率存在明显差异(P<0.01)，并随宫颈病变级别的升高Ki-67表达呈上升趋势，见表2。

表2 Ki-67在不同级别宫颈病变中的表达情况

2.3 P53在不同级别宫颈病变中的表达P53主要表达于宫颈鳞状上皮细胞核，为棕黄颗粒状沉积。在宫颈炎组、LSIL组、HSIL组中P53的阳性表达率随宫颈病变级别的升高呈上升趋势，三组间表达阳性率差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 P53在不同级别宫颈病变中的表达情况

2.4 p16、Ki-67和P53诊断高级别宫颈上皮内病变的效能评价

分别以“+”、“++”、“+++”作为切入点，计算各指标诊断HSIL的灵敏度和特异度，通过比较，本实验选择阳性表达“++”为切入点进行下一步统计学分析；通过并联(即平行试验，当检测指标中每一个为阳性即可诊断为阳性)、串联(即系列试验，当检测指标中每一个均为阳性方可诊断为阳性)进一步评价诊断效能。结果显示：单独使用p16和P53灵敏度和特异度诊断效能均较高；但在单独应用Ki-67作为标志物时，通过串联方式，联合应用p16和P53可提高HSIL诊断的特异性，见表4。

表4 三种生物学指标单独或联合检测诊断HSIL的效能评价表(%)

3 讨论

宫颈鳞状细胞癌的发生是一个较为漫长的过程，在这个过程中存在着多种基因和蛋白的变化，作为SCC癌前病变的SIL被区分为LSIL和HSIL，其中LSIL大部分可自然消退，而HSIL具有癌变潜能，可发展为SCC，因此精准诊断并及时治疗HSIL至关重要。由于LSIL和HSIL在组织形态上为连续病变，并无截然的分界线，加上病理科医生的主观判断存在差异，因此存在过度诊断和漏诊等情况。研究表明，在LSIL(宫颈上皮内瘤变Ⅰ级)中，只有64%的病理诊断相同；在HSIL(宫颈上皮内瘤变Ⅱ级)，相同诊断小于50%[8]。为了提高SIL 诊断的一致性，学者们提出，将一些特异性生物化学指标引入，协助诊断[9]。妇科病理学领域，P16免疫组化已经广泛应用于宫颈癌前病变的病理诊断中，大量研究资料表明，宫颈病变级别越高，P16阳性表达率越高，P16表达情况与病人病情呈正相关[4,10-11]。本研究发现宫颈炎组中P16阳性表达率为15%，LSIL中P16阳性率为73.33%，HSIL中P16阳性率为95%，p16的阳性表达率随宫颈病变级别的升高呈上升趋势，差异有统计学意义(P<0.01)，进一步证实P16是评估宫颈病变的可靠指标，有助于宫颈鳞状上皮内病变的分级诊断。

Ki-67存在细胞周期中除G0期以外的所有阶段，是目前较为肯定的核增殖标志物，研究表明Ki-67表达与宫颈病变的严重程度正相关[12]，联合p16和Ki-67可提高SIL筛查的灵敏度和特异度[13]。本研究结果显示，Ki-67在宫颈炎中阳性表达率为8.33%，LSIL中阳性率为65.00%，HSIL中阳性率为86.67%，Ki-67的阳性表达率随宫颈病变级别的升高呈上升趋势，差异有统计学意义(P<0.01)。与上述研究结果相符。P53是参与细胞周期G1/S期转换的重要调控分子，与大多数恶性肿瘤相关。P53易发生突变，突变型p53起原癌基因的作用，抑制细胞凋亡并促进细胞恶性转化[14]。本实验中P53在正常宫颈上皮中的表达率较低，SIL中表达较高，并且随着SIL级别增高，P53表达增高，差异有统计学意义(P<0.01)。

本研究通过免疫组化法检测并分析了p16、Ki-67和P53在HSIL中的表达情况，发现单独应用p16灵敏度和特异度分别为90%和95.8%，单独应用p53灵敏度和特异度分别为95%和96.8%，均高于单独应用Ki-67(86.7%和88.3%)；三者联合免疫组化检测后，通过串联或并联实验，其诊断的灵敏度和特异度均优于单独检测。但考虑到检验成本的问题，对于临床上可疑高度宫颈病变，而p16、Ki-67检测不支持HSIL时，建议增加P53免疫组化检测，最大限度的减少主观判断，提高病理诊断的精准度和可重复性，指导个体化治疗。另外，本实验入组的样本量偏少，本实验结论有待后期更大样本统计分析进一步验证。