王 丽，庞 俊，陈庆伟，李桂琼，柯大智，李兴升

(重庆医科大学附属第二医院 老年病科，重庆 400010)

根据流行病学调查，目前中国每年约有2.3亿人罹患心血管疾病，心血管疾病已成为危害人类身体健康的主要疾病之一。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是以动脉内膜的脂质沉积和粥样硬化斑块形成为主要特征，是心血管疾病死亡的重要原因[1]。AS斑块破裂和继发性血栓形成是导致急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的主要病因[2]，而内皮功能紊乱及AS斑块的不稳定是易损斑块破裂的重要致病原因[3]。

Ghrelin是从大鼠胃黏膜中分离纯化的一个含有28个氨基酸的多肽，是生长激素促分泌物受体(growth hormone secretagogue receptor,GHSR)的内源性配体。Ghrelin具有降低血压[4]、抗感染、抗氧化[5]、保护血管内皮细胞[6]、改善心衰[7]、对抗动脉粥样硬化等[8]多种生物学效应，提示其对心血管系统具有重要的保护作用。然而，ghrelin对易损斑块合并心肌梗死患者内皮功能和斑块稳定性的影响目前尚无报道。在该研究中，通过高脂饮食饲养ApoE基因敲除小鼠诱导AS易损斑块，并结扎冠状动脉左前降支构建易损斑块+急性心肌梗死双模型，探讨ghrelin对双模型小鼠内皮功能和斑块稳定性的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料与试剂：Ghrelin、RAM-11和α-actin抗体(Abcam公司)；油红O(Sigma-Aldrich公司);一氧化氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);Masson染色试剂盒(康为试剂)。高脂饲料：基础饲料79%+脂肪21%+胆固醇0.15%(由第三军医大学大坪医院实验动物中心合成)。

1.1.2 动物：8周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠30只，体质量26～29 g[北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004]。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：将ApoE-/-小鼠分为对照组、双模型组和ghrelin干预组。所有ApoE-/-小鼠均高脂饮食喂养12周诱导AS易损斑块，构建的AS易损斑块模型即为对照组。在第8周时，双模型组和ghrelin干预组结扎冠状动脉左前降支构建急性心肌梗死模型。在急性心肌梗死造模后，ghrelin干预组腹腔注射ghrelin(100 μg/kg，一天两次),直至第12周实验结束。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.2.2 M型超声检测小鼠心功能：4周后，用超声心动图检测各组小鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)(在重庆医科大学儿童医院心脏超声科完成)。所有测量采用双盲法，由心脏超声专业医师进行测定。

1.2.3 血脂及NO水平的测定：超声检查后，隔夜禁食采眼眶血，全自动生化分析仪测定血浆三酰甘油(trigly ceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C和高密度脂蛋白胆固醇HDL-C(在重庆医科大学附属第二医院检验科测定)。Griess法检测各组小鼠血浆一氧化氮(NO)水平。

1.2.4 形态学及免疫组化的检测：断颈处死小鼠，仔细分离心脏和整个腹主动脉，行HE染色和苦味酸天狼猩红染色，RAM-11及β-actin免疫组化染色检测斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞的分布。用IPP6.0软件测定主动脉斑块面积与管腔面积百分比、斑块内脂质和胶原的分布。计算易损指数=(RAM11+油红O)染色百分比/(α-actin+天狼猩红)染色百分比。

1.2.5 Masson染色检测心肌梗死面积：用Masson染色检测各组小鼠心肌梗死面积。应用IPP 6.0软件测量并统计坏死心肌与全部左心室心肌面积的百分比，各组取其平均值。

1.2.6 Real-time PCR和Western blot检测各组VEGF的mRNA和蛋白表达：提取梗死边缘区心肌组织RNA，real-time PCR检测VEGF的mRNA表达。引物序列如下：VEGF(154 bp)，上游：5′-AG AAGCAGTCCCTGGAGTAGA-3′，下游：5′-TCCGATC TCCAGTTAGCACC-3′；内参β-actin(174 bp)，上游：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，下游：5′-AT GCCACAGGATTCCATACC-3′。反应条件：第1次循环95 ℃ 2 min，其后以95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循环40周期，最后72 ℃ 5 min终止。目的基因与β-actin的相对比值作为其表达量，采用2-△△Ct方法计算相对比值。

提取梗死边缘区心肌组织总蛋白，Western blot检测VEGF的蛋白表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白印迹到PVDF膜上。5%脱脂牛奶浸泡封闭1 h，加一抗(anti-VEGF，1∶1 000；β-actin，1∶2 000)4 ℃摇晃过夜，用TBST液洗膜3次。加二抗(1∶1 000)室温下摇晃2 h。用TBST液洗膜3次。利用化学发光法进行图像扫描，保存图像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠体质量、血脂及NO2-/NO3-水平

双模型组TG较对照组升高不明显，而ghrelin干预组却显著下降(P<0.05)。双模型组血清NO2-/NO3-水平显著低于对照组(P<0.001)，ghrelin干预后显著回升双模型组血清NO2-/NO3-水平(P<0.001)(表1)。

表1 各组小鼠体质量及血脂变化

2.2 小鼠AS斑块面积的评估

双模型组小鼠腹主动脉斑块表面积、横断面面积较对照组升高不明显，而ghrelin干预后可明显减少双模型组小鼠主动脉斑块的表面积和横断面面积(图1A～D)(P<0.001)。

A.Oil Red O staining; B.HE staining(×200); C.plaque surface area (%); D.plaque cross sectional area(%); *P<0.001 compared with the control group; #P<0.001 compared with the double model group

2.3 小鼠心功能变化

双模型组LVEF和LVFS较对照组明显降低(P<0.01)，ghrelin干预后使双模型组LVEF和LVFS显著回升(图 2)(P<0.05)。

*P<0.01 compared with the control group; #P<0.05 compared with the double model group

2.4 Ghrelin对各组小鼠粥样斑块稳定性的影响

双模型组斑块内胶原纤维、平滑肌细胞、脂质和巨噬细胞的分布、斑块的易损指数较对照组升高不明显，ghrelin干预后可显著增加双模型组斑块内胶原纤维和平滑肌细胞的分布(P<0.001)，降低斑块内脂质和巨噬细胞的分布(P<0.001)，减低易损指数(图3，表2)(P<0.01)。

表2 各组小鼠腹主动脉斑块易损指数的比较

图3 各组中脂质、巨噬细胞、胶原纤维和平滑肌细胞的组成

2.5 Ghrelin对各组小鼠心肌梗死面积的影响

双模型组梗死周边区间质纤维增生较对照组明显加重(图4A)，腹腔注射ghrelin干预后可见其间质纤维的增生较双模型组明显减少(图4A)。IPP6.0计算各组心肌梗死面积的百分比(直方图所示，图4B)。

A.Masson staining(×400); B.myocardial infarction area(%); *P<0.001 compared with the control group; #P<0.001 compared with the double model group; scare bar=250 μm

2.6 各组小鼠VEGF的mRNA和蛋白表达

双模型组心梗周边区缺血心肌VEGF的mRNA(图5A)和蛋白表达较对照组明显升高(图5B，C)，ghrelin干预后可显著增加双模型组缺血心肌VEGF的mRNA(图5A)和蛋白表达(图5B,C)。

A.relative expression of mRNA; B.Western blot for VEGF; C.relative expression of protein; *P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the double model group

3 讨论

AS斑块破裂和继发性血栓形成是导致AMI的主要病因[2]。内皮功能紊乱及AS斑块的不稳定是易损斑块破裂的重要致病原因[3]。研究发现，ghrelin及GHSR在左心房、左心室及主动脉、冠状动脉、微血管内皮细胞均有广泛表达[9]，且具有一系列心血管系统保护作用[4-8]。那么，ghrelin对易损斑块合并心肌梗死患者内皮功能和斑块稳定性的影响及相关机制如何，目前尚无研究报道，这将是本课题所要探讨的重点内容。

ApoE是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白受体的配体，ApoE缺乏则导致血液循环中富含胆固醇的物质积累，而导致AS病灶的产生[10]。在该研究中，ghrelin可明显减少双模型组小鼠主动脉斑块的表面积和横断面面积、降低血浆TG水平，提示ghrelin可通过降低血浆TG水平、缩小斑块面积延缓易损斑块合并心肌梗死小鼠AS病变进展。NO作为血管内皮分泌的血管舒张因子，具有舒张血管、抑制血小板聚集与黏附、抑制细胞凋亡与增生、抗感染等一系列生物学效应[11]，是预测冠心病的独立危险因素之一[12-13]。Ghrelin可显著升高双模型组血清NO水平，提示ghrelin可以显著改善易损斑块合并AMI小鼠血管内皮损伤、稳定AS易损斑块。

在该研究中，ghrelin干预后显著降低了易损斑块合并AMI小鼠易损指数、增加了斑块稳定性，减少了二次梗死的可能、改善了临床此类患者的不良预后。VEGF是目前已知的功能最强的促有丝分裂素，能特异性作用于血管内皮细胞，诱导内皮细胞的增生、迁移，在生理性和病理性血管新生过程中发挥着重要作用[14]。该研究发现ghrelin可通过上调VEGF的表达、从而增加梗死周边区心肌微血管生成密度，降低心肌梗死面积，进一步提高双模型组小鼠的心功能，这与上述研究证实的ghrelin具有促进双模型小鼠心梗周边区后血管新生、改善冠脉微循环的血流灌注是密切相关的。

综上所述，该研究结果首次证实了ghrelin可改善ApoE敲除小鼠心肌梗死后血管内皮功能、促进易损斑块合并心梗患者斑块稳定性，减少二次梗死发生、改善患者预后。但该实验结果仅仅局限于动物的在体实验研究，究竟ghrelin在人体内是否具有相似的作用效果，尚待进一步的研究。