贾春松，赵彦坡，尚振华，邢添瑛，欧彤文*

(1.首都医科大学宣武医院 泌尿外科， 北京 100053； 2.门头沟区医院 神经内科， 北京 102300)

骶上脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)通常导致神经源性膀胱(neurogenic bladder，NB)，表现为逼尿肌过度活动(detrusor over activity，DO)和膀胱纤维化等膀胱功能和结构异常以及尿急、尿频、尿失禁和尿潴留等临床症状。转化生长因子β (transforming growth factor β，TGF-β)是调节细胞生长、分化和免疫功能的细胞因子之一[1]，其中，TGF-β1是促进组织纤维化的重要因子[2]，它可能是治疗NB的靶点。但是，目前相关研究较少。在本研究中，用慢病毒介导的短发夹RNA(sh-TGF-β1)靶向干扰膀胱TGF-β1 mRNA表达，并从膀胱功能和纤维化两个方面，探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)降低膀胱TGF-β1表达，治疗脊髓损伤大鼠NB的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：PCR引物(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)； DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Trizol试剂(Invitrogen公司)；Prime-Script RT试剂盒和一步法SYBR RT-qPCR试剂盒(TaKaRa公司)；兔抗TGF-β1单克隆抗体(Abcam公司)；小鼠抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；12.5% SDS-PAGE凝胶、PVDF膜(Bio-Rad公司)；TGF-β1 RNAi慢病毒载体LV-shTGF-β1及其对照慢病毒载体LV-vector为本实验室既往构建[3]。

1.1.2 动物：Wistar雌性大鼠[北京维通利华，使用许可证号：SYXK(京)2017 -0033]，SPF级，体质量(200±10)g。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠随机分为4组：假手术组(sham)、T10脊髓横断组(T10 transec-tion)、LV-vector和LV-shTGF-β1组，每组12只。将大鼠用2%异氟醚麻醉后，假手术组行T10脊髓横断假手术，其余3组行T10脊髓横断。脊髓术后，下腹部正中开口，行膀胱肌层注射(每只80 μL)：假手术组和T10脊髓横断组为0.9%氯化钠溶液，LV-vector组为LV-vector 1×108pfu/只，LV-shTGF-β1组为LV-shTGF-β1 1×108pfu/只。大鼠膀胱壁注射方法和术后护理见既往报道[4]。本实验通过本院伦理委员会批准。

1.2.2 膀胱测压、称重和取材：在脊髓术后第28天，将大鼠称重，按既往方法行清醒大鼠膀胱测压[4]。记录液体从尿道流出前，DO的频率、幅度及膀胱容量。DO定义为：节律性逼尿肌压较基线升高超过7 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，但是没有液体从尿道流出[4]。测压后处死大鼠，摘取膀胱称重，并将膀胱通过矢状面和冠状面分为4块，其中3块剥离膀胱黏膜和浆膜，保留逼尿肌层并保存在液氮中；另一块用4%甲醛固定后石蜡包埋。

1.2.3 HE染色检测逼尿肌纤维化：将石蜡包埋的膀胱组织制成4 μm切片，分别行HE和Masson染色。每只大鼠随机选取3张HE切片，在放大倍数×10时，随机选取每张切片中逼尿肌层的3个区域，用Fiji-win64(NIH Image)软件分析逼尿肌纤维化程度，其计算方法为：间质组织百分比=(间质组织面积/逼尿肌面积)×100。

1.2.4 免疫组化法检测TGF-β1 蛋白：每只大鼠随机选取3张4 μm石蜡切片，进行免疫组化染色。其中，一抗为兔抗TGF-β1单克隆抗体(1∶200)，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶50)。在放大倍数×10时，随机选取切片中逼尿肌层的3个区域，用Fiji-win64(NIH Image)软件进行分析，TGF-β1表达用平均吸光度(average absorbance)×100表示。

1.2.5 Western blot检测TGF-β1 蛋白：将冻存的逼尿肌匀浆后，4 ℃ 12 000×g离心10 min，并收集上清。将蛋白按30 μg/只大鼠，用12.5% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。将PVDF膜用一抗兔抗TGF-β1单克隆抗体(1∶50 000)和小鼠抗GAPDH 单克隆抗体(1∶10 000)在4 ℃下孵育过夜，接着用二抗HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)和HRP标记的山羊抗小鼠IgG (1∶40 000)在室温下孵育1 h。每个样本重复检测3次。

1.2.6 RT-qPCR检测TGF-β1 mRNA：将冻存的逼尿肌匀浆后，按Trizol试剂和Prime-Script RT试剂盒说明制备cDNA。RT-qPCR的引物为：TGF-β1(上游引物：5′-GCTGAAGCCGTTCATTTAGC-3′；下游引物：5′-GAGGAGGCCAAATTCAACAA-3′)、GAPDH(上游引物：5′-ACAAGATGGTGAAGGTCGGTG-3′； 下游引物：5′-AGAAGGCAGCCCTGGTAACC-3′)。RT-qPCR的反应体系为：1 μL cDNA (10 ng)，2 μL 10×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP，0.2 μL Ex Taq®Hot Start Version，2 μL SYBR Green Ⅰ，1 μL (10 μmol)上游引物， 1 μL(10 μmol)下游引物和11.8 μL DEPC处理水；扩增条件为：95 ℃变性2 min，再扩增40个循环(95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s)，72 ℃ 30 s。每个样本重复检测3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 膀胱测压和膀胱质量变化

与假手术组相比，3组脊髓横断大鼠的DO频率和幅度均显著增加(P<0.01)，且膀胱容量显著减小(P<0.05)(图1，表1)。LV-shTGF-β1组DO的频率和幅度较T10脊髓横断组或LV-vector组均显著减少(P<0.01)，且膀胱容量均显著增加(P<0.01)(图1，表1)。3组脊髓横断大鼠的膀胱质量和膀胱质量/体质量均较假手术组显著增加(P<0.01)。LV-shTGF-β1组膀胱质量和膀胱质量/体质量较T10脊髓横断组或LV-vector组均显著减少(P<0.05)(表1)。

图1 膀胱测压的示例

表1 膀胱测压参数和膀胱质量变化

2.2 逼尿肌纤维化变化

与假手术组相比，3组脊髓横断大鼠的逼尿肌间质组织百分比均显著增加(P<0.01)(图2)。LV-shTGF-β1组间质组织百分比较T10脊髓横断组或LV-vector组均显著减少(P<0.05)(图2)。

A.bladder slides with HE and Masson staining; B.levels of interstitial tissue in the HE staining; *P<0.01 compared with sham group; #P<0.05 compared with T10 transection or LV-vector group

2.3 逼尿肌TGF-β1表达的变化

与假手术组相比，3组脊髓横断大鼠的逼尿肌TGF-β1表达均显著增加(P<0.01)(图3)；LV-shTGF-β1组TGF-β1表达较T10脊髓横断组或LV-vector组均显著减少(P<0.05)(图3)。Western blot检测TGF-β1蛋白表达(图4，表2)和RT-qPCR法检测TGF-β1 mRNA表达(表2)，其结果与免疫组化法均类似。

表2 Western blot和RT-qPCR检测TGF-β1表达的变化

A.bladder slides with TGF-β1 immunohistochemistry; B.levels of TGF-β1 expression;*P<0.01 compared with sham group; #P<0.05 compared with T10 transection or LV-vector group

图4 Western blot检测TGF-β1表达

3 讨论

SCI的患病率在世界上高达(236～1 298)/100万人[5]，多达95%的患者存在NB，仅有不到1%患者出院时膀胱功能能够完全恢复[6]。对骶上SCI患者，抑制DO和改善膀胱纤维化，能够降低逼尿肌压和增加膀胱容量，从而改善患者的排尿异常和保护肾功能。

M受体阻滞剂和A型肉毒毒素常用于神经源性DO 的治疗[7]，但是，抑制膀胱TGF-β1表达能否抑制DO尚无研究。在脊髓发育不良的神经源性DO儿童，有肾脏瘢痕或逼尿肌漏尿点压较高(>40 cmH2O)的患者，尿中TGF-β1含量显著增加[8]，且A型肉毒毒素膀胱壁注射后，其含量显著降低[9]。在原代培养的逼尿肌细胞，通过RNA干扰，LV-shTGF-β1载体能够减少57% TGF-β1的表达[3]。本研究发现，LV-shTGF-β1载体能够通过减少膀胱TGF-β1表达而抑制SCI大鼠的DO。该作用机制不清，不能除外基因治疗影响了膀胱壁乙酰胆碱信号传导，或是它减轻了膀胱纤维化，从而进一步影响膀胱功能。

膀胱纤维化的典型病理特征是：逼尿肌肌束内和肌束间过多的间质组织沉积[10]，通常伴有逼尿肌细胞的肥大/萎缩和膀胱质量的增加[11]。但是，目前膀胱纤维化尚无有效的治疗措施[12]。TGF-β1能够诱导纤维细胞-成肌纤维细胞的转化和细胞间质的生成，在人类肝脏、肺、心脏和肾纤维化疾病中起重要的促进作用[13]。在原代培养的人类逼尿肌细脆骨，TGF-β1能使细胞变肥大以及增加细胞外的基质[14]。在SCI大鼠，膀胱组织的TGF-β1 mRNA含量显著增加[15]。本研究发现，利用LV-shTGF-β1膀胱壁注射抑制膀胱TGF-β1表达，能够减轻SCI大鼠的膀胱质量和减少逼尿肌的间质沉积。

综上所述，在T10脊髓横断大鼠，膀胱壁注射LV-shTGF-β1能够通过减少膀胱TGF-β1表达而抑制DO和改善膀胱纤维化。该研究可能为NB的治疗提供新的思路。