孔德欣，黄 薇，杨 楠，刘雁勇

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 药理学系，北京 100005)

恶性肿瘤是目前全球主要的死因之一[1]。据美国癌症协会估计，2020年全球新发癌病例为1 930万，癌死亡病例近1 000万，预计2040年全球癌症负担将达到2 840万例，比2020年增加了47%[2]，如此高的发病率和病死率说明目前癌诊治仍然面临很大的挑战。热休克蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)作为细胞中重要的分子伴侣蛋白，负责调控多种蛋白的成熟与稳定，在肿瘤的发生发展和转移中发挥着重要作用[3-4]。本实验室前期通过噬菌体展示技术获得了靶向多肽P7(LPLTPLP)，能特异性结合细胞膜表面及细胞内的Hsp90。本研究应用多器官肿瘤与边缘组织组合芯片，分别通过免疫组化和免疫荧光染色法分析不同肿瘤组织及癌旁组织Hsp90的表达水平以及FITC-P7对其的识别效果，并对两者的相关性进行统计学分析，进一步证实了P7是肿瘤靶向识别的优异配体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例:多器官组织芯片(X096Mc01)购自中科光华智能生物科技有限公司，共包括16种器官肿瘤及匹配或不匹配的边缘或癌旁组织(食道、胃、结肠、直肠、肝、肺、肾、乳腺、宫颈、卵巢、膀胱、淋巴结、皮肤、脑、前列腺、胰腺)，共计48例不同癌症患者组织标本，其中男26例, 女26例, 年龄范围在36～82岁，平均年龄为57.8岁(中位数56.5岁)。按WHO病理分级，包括Ⅰ期9例、Ⅱ期9例、Ⅲ-Ⅳ期17例；依据AJCC第7版制定的标准，除无临床分期的病例，该芯片包括1期5例、2期25例、3期4例；按TNM分期，包括T1-T2期18例、T3-T4期21例；该芯片包括淋巴结转移病例12例、无淋巴结转移病例27例，所有病例均无远端转移。

1.1.2 试剂与材料:兔抗人Hsp90单克隆抗体(Cell Signal Technology公司)；通用型免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；柠檬酸抗原修复液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；FITC-P7(上海强耀生物科技有限公司定制)；其他试剂(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色法:采用免疫组化方法检测Hsp90表达：组织芯片脱蜡水化，柠檬酸抗原修复液于97 ℃修复15 min，自然冷却至室温，10%血清封闭，孵育一抗4 ℃过夜，参照通用型免疫组化二步法检测试剂盒说明操作。分别于4倍和40倍物镜下观察Hsp90在肿瘤与癌旁组织中表达情况。镜下组织结构完整、清晰、定位明确、胞质或胞核为棕黄色可判断为Hsp90染色阳性。在40倍物镜下，组织芯片的每个点任选3个视野拍照，用IPP 6.0软件通过宏操作进行吸光度分析。测定每个组织点特定区域的面积(area)和积分吸光度(integrated absorbance，IA)，并按以下公式计算各点的平均光密度：平均吸光度=SUM(IA)/SUM(area)，表示该组织点的Hsp90表达测量值。

1.2.2 免疫荧光染色法：采用免疫荧光染色法检测FITC-P7对不同肿瘤组织及癌旁组织的识别效果：组织芯片脱蜡水化，0.3%过氧化氢去除内源性过氧化氢酶，10%血清封闭，TBS预孵育30 min，FITC-P7避光孵育90 min后封片，于荧光显微镜下观察。在20倍物镜下，组织芯片的每个点任选3个视野拍照，用 IPP 6.0软件通过宏操作进行荧光强度的定量分析。测定每个组织点特定区域的面积(area)和积分吸光度(IA)，并按以下公式计算各点的平均光密度：平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)=SUM(IA)/SUM(area)，表示该组织点的P7识别测量值。

1.3 统计学分析

应用Graph Pad Prism 6.0软件进行统计学分析, 两组间差异采用Student’st检验，P<0.05判定为有统计学意义。使用Shapiro-Wilk正态分布检验对各组数据进行正态分布检验，符合正态分布的两组数据采用Pearson相关性分析；Pearson相关性系数定义：0.9

2 结果

2.1 Hsp90在不同肿瘤及癌旁组织中的表达水平

组织芯片样本包括16种器官肿瘤及匹配或不匹配的边缘或癌旁组织(食道、胃、结肠、直肠、肝、肺、肾、乳腺、宫颈、卵巢、膀胱、淋巴结、皮肤、脑、前列腺、胰腺)，每种器官肿瘤及边缘或癌旁组织各3点。免疫组化染色后的阵列排列见图1A。在48例不同组织肿瘤及癌旁组织中，肿瘤组织的Hsp90表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01)(图1B)。食管、肾、宫颈、脑的代表性免疫组化图像见图1C。分别比较16种不同肿瘤及相应癌旁组织的Hsp90表达水平，除直肠与皮肤组织外，所有肿瘤组织较癌旁组织均表现出Hsp90升高的趋势，其中脑、子宫颈、食管、肾、肺、卵巢、前列腺、胃的肿瘤组织表达水平显著高于相应癌旁组织(P<0.05)(图2)。

A.tissue array arrangement diagram (×40), a1-3,a4-6,a7-9,a10-12,c1-3,c4-6,c7-9,c10-12,e7-9,e10-12,g1-3,g4-6,g7-9,g10-12 were cancer tissues of esophagus, stomach, colon, rectum, liver, lung, kidney, breast, cervix, ovary, bladder, lymph gland, skin, brain prostate and pancreas, b1-3,b4-6,b7-9,b10-12,d1-3,d4-6,d7-9,d10-12,f1-3,f4-6,f7-9,f10-12,h1-3,h4-6,h7-9,h10-12 were para-carcinoma tissues of esophagus, stomach, colon, rectum, liver, lung, kidney, breast, cervix, ovary, bladder, lymph gland, skin, brain, prestate and pancreas; B.overall expression levels of Hsp90 in 16 types of tumor tissues and para-carcinoma tissues; C. expressions of Hsp90 in 4 cases of typical pathological specimens; *P<0.05, **P<0.01 compared with para-carcinoma group

A-P.difference of Hsp90 expression between tumors and para-carcinoma tissues in bladder, brain, breast, cervix, colon, esophagus, kidney, liver, lung, lymph gland, ovary, pancreas, prostate, rectum, skin, stomach. The expression levels of HSP90 in brain, cervix, esophagus, kidney, lung, ovary, prostate, stomach tumors were significantly higher than that in para-carcinoma tissues; *P<0.05, **P<0.01 compared with para-carcinoma group

2.2 FTTC-P7对不同肿瘤及癌旁组织的识别效果

根据40倍物镜下拍摄的荧光图像及定量数据，结果显示FITC-P7对所有类型的肿瘤及相应癌旁组织的识别效果无显著性差异(图3A)。食管、肾、宫颈、脑的代表性免疫荧光图像见图3B。在16种肿瘤类型中，脑、乳腺、结肠、食管、宫颈、淋巴结、胰腺、前列腺、直肠的肿瘤组织较癌旁组织表现出更高的FITC-P7染色水平，其中乳腺癌的肿瘤识别水平显著高于癌旁组织(P<0.05)(图4)。

A.overall recognition effect of P7 in 16 types of tumor tissues and para-carcinoma tissues; B.fluorescence intensity of tumor tissues and para-carcinoma tissues of esophagus, kidney, cervix, brain; MFI.mean fluorescence intensity

A-P.the recognition effects of FITC-P7 between tumors and para-carcinoma tissues in bladder, brain, breast, cervix, colon, esophagus, kidney, liver, lung, lymph gland, ovary, pancreas, prostate, rectum, skin, stomach; FITC-P7 preferably recognized tumor tissues in brain, breast, colon, esophagus, cervix, lymph gland, pancreas, prostate and rectum compared with respective para-carcinoma tissues; the breast cancer showed a significant prominent FITC-P7 staining; *P<0.05, **P<0.01 compared with para-carcinoma group; MFI.mean fluorescence intensity

2.3 P7对肿瘤的识别效果与Hsp90表达水平的相关性分析

所有肿瘤组织的综合分析表明，在肿瘤组织中，随着Hsp90表达水平的升高，P7对肿瘤的识别效果更强，Pearson相关性分析结果显示二者具有中度相关性(r=0.5147，P<0.01)。

3 讨论

Hsp90是细胞内重要的分子伴侣蛋白，调节400多种客户蛋白的构象成熟及其稳定性。抑制 Hsp90 能够影响多条信号通路，其是重要信号通路“节点”[5]，也是抗肿瘤药物研发重要靶点[6]。除细胞内定位外，Hsp90已被发现定位于多种恶性细胞的细胞膜上，介导肿瘤的侵袭和转移等过程[7]。虽然Hsp90在所有细胞内广泛存在，但在非肿瘤组织细胞膜上几乎不表达，因而使其成为肿瘤靶向的优异靶点。

P7是本实验室前期筛选得到的具有Hsp90靶向与抑制双重功能的多肽，实验证实P7能特异性结合细胞膜表面及细胞内Hsp90[10]。本研究通过免疫组化染色法对48例16种器官肿瘤及匹配或不匹配的边缘或癌旁组织Hsp90表达水平进行了分析，发现在多种肿瘤中Hsp90呈现高表达，而在边缘或癌旁组织中表达量较低。此外，通过荧光染料FITC标记的FITC-P7，定量检测了多肽P7对不同肿瘤及癌旁组织的识别效果，结果FITC-P7对肿瘤组织和癌旁组织的识别效果的差异无统计学意义，但总体对肿瘤组织的识别能力更强。为了进一步证实P7对肿瘤的靶向能力与Hsp90表达水平的关系，对两组数据进行了相关性分析，结果表明二者具有中度相关性。由于组织芯片无法区分膜蛋白及胞质蛋白，无法定量检测细胞表面Hsp90蛋白的表达水平及细胞膜FITC-P7染色，因而胞质蛋白可能会对癌旁与癌组织的Hsp90蛋白表达差异以及P7的特异性识别造成一定干扰。采用活组织或活细胞进行特异性细胞表面Hsp90蛋白与FITC-P7染色检测将可能获得更为精准的结果，有待后续研究。综上所述，本研究表明P7是肿瘤靶向识别的优异配体，以P7为配体开发新型靶向治疗和诊断策略将具有较好临床前景。