毛露甜，朱蔚健，徐良雄，练英铎，夏树敏，吕镇城

（1.惠州学院 生命科学学院；2.澳宝化妆品（惠州）有限公司，广东 惠州 516007）

近年来，安全、温和、功效型化妆品受到人们的青睐，但很多化妆品中添加了如胶原蛋白、透明质酸、多肽、银耳多糖等植物来源的功能性提取物，这大大增加了化妆品被污染的风险［1-2］．化妆品常见的微生物污染有细菌性污染（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等）和真菌性污染（黑曲霉、黄曲霉等）等［3］．

化妆品的原材料、生产环境、生产设备以及半成品膏体都容易受到霉菌的污染，其中面膜类产品受霉菌污染尤为明显［4］．化妆品被黑曲霉污染是导致化妆品变质的一个重要因素．黑曲霉广泛存在于自然界中，在温暖潮湿的南方地区尤其容易生长繁殖，它通过次生代谢途径合成黄曲霉毒素、单端孢菌毒素等，有一定的致癌性，严重危害人体健康［5］．

化妆品的防腐历来是化妆品研发中的一个重要环节．2015年新版《化妆品安全技术规范》中允许使用的51种防腐剂大都是化学合成物质［6］，其中卡松、甲基氯异噻唑啉酮、尼泊金酯类等多种常用的防腐剂对人体具有一定的刺激性以及潜在的安全风险［7］．另外，由于环境污染，敏感性肌肤的人群越来越多，开发安全高效、低毒温和的防腐剂是当前化妆品防腐剂的研究热点，但目前还极少研究植物内生真菌代谢物在化妆品中的抑菌活性．

植物内生真菌有产生杀虫、抗菌、抗癌的生物活性物质的潜能，内生菌及其代谢产物具有很高的研究价值［8-9］．西藏的地理环境独特，藏地植物长期生长在高海拔、低氧、高寒区域，对极端环境有较好的耐受力．此研究有望从中分离到与普通生境不一样的独特内生真菌，以期能研发出一种新颖的抗黑曲霉活性的代谢物．本实验通过对藏地植物内生菌的分离纯化、发酵培养，发酵代谢物提取和活性筛选，并对活性菌种进行鉴定，为后续化妆品新型抗菌活性次生代谢产物的发现奠定基础．

1 材料和方法

1.1 材料

植物采样：2018年12月于西藏林芝地区的雅尼国家湿地公园、林芝索松林普巴等地采集桃花、砂生槐、柽柳等植物样本6份，同时对植物进行鉴定和编号．

测试菌：黑曲霉（Aspergillus niger）由惠州学院天然产物化学实验室提供，2018年8月分离自高良姜．

1.2 试剂与仪器

试剂：甲醇、次氯酸钠、乙醇、甘油、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、氯化钠等常规试剂均为分析纯；硫酸链霉素（纯度98%，上海麦克林生化科技有限公司）．

培养基：（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：将200 g马铃薯削皮切块小火煮沸30 min，3层纱布过滤，加葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，加自来水定容至1000 mL；（2）大米或玉米固体培养基：每个发酵瓶放入大米或玉米60 g，加自来水60 mL；上述培养基均以121℃高压蒸汽灭菌15 min，备用．

仪器：SW-CJ-2FD超净工作台、GR60DR自动电热压力蒸汽灭菌锅、TE212电子精密天平、电热恒温干燥箱、RV10 digital旋转蒸发仪、SB25-12D超声波清洗机、BSD-TX370恒温震荡培养箱、SPX-250生化培养箱、9700型PCR仪．

1.3 实验方法

1.3.1 组织分离法分离纯化植物内生真菌

用2.5%次氯酸钠和70%乙醇依次消毒植物的茎、叶等组织，组织分离法在PDA平板上挑选单菌落获得纯种［10］．对获得单菌落的内生真菌进行拍照并编号入库，将纯培养物分别置于4℃、-20℃和-80℃冰箱中保藏菌种．

1.3.2 内生真菌的固体发酵及其代谢物的提取

用无菌吸管从纯培养的平板中戳取6-8个菌块，分别接种在大米、玉米发酵培养基中，每株内生真菌用玉米、大米培养基各发酵一瓶，于28℃暗房中恒温培养30 d，期间不定期观察记录发酵现象．

30 d后，往发酵瓶中加入100 mL乙酸乙酯，浸提过夜，捣碎，过滤收集发酵粗提物，转移至旋转蒸发仪浓缩至干燥，加入3 mL甲醇溶解，得到内生真菌的代谢粗提物［11］．

1.3.3 内生真菌活性代谢物的筛选

黑曲霉孢子液的制备［12］：用巴氏管吸取2 mL无菌水于活化培养的黑曲霉平板中，轻轻震荡收集黑曲霉的孢子液．用无菌棉签沾取少量孢子液均匀涂PDA平板，将预先准备好的含10 μL粗提物的滤纸片（直径5 mm）放置于上述含测试菌液的PDA平板上，每张滤纸片的间距不小于24 mm，纸片中心距平板边缘应不小于15 mm，每个平板上贴放6张滤纸片，于28℃恒温培养2-3 d，每隔12 hr观察并记录抑菌圈大小．

1.3.4 抗黑曲霉活性菌株的分子鉴定

内生真菌DNA的提取选用改良的CTAB法［13］．1 mL黑曲霉的菌丝球经600 μL 5%CTAB提取液和10 μL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K处理，用细胞破碎仪研磨10 min，于65℃水浴1hr（其间颠倒混匀3-4次），冷却至室温，加入等体积酚-氯仿（1∶1），上下颠倒10 min，11000 rpm离心10 min，将上清液移至新的离心管，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀后放-20℃冰箱静置20 min，离心弃除上清液，加70%乙醇使DNA沉淀并挥发干，用20 μL TE缓冲液溶解，于-20℃保存．

根据真菌18S rDNA保守区设计引物，采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增．

引物合成序列如下：

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATAGC

PCR扩增采用30 μL的反应体系和35个循环条件，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送交北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司测序．用SeqMan进行序列的人工校正，在GenBank进行Blast序列比对，使用MEGA 6.0软件进行NJ树的构建．

2 结果与分析

2.1 藏地植物内生真菌的分离纯化

本次共分离纯化得到内生真菌78株，部分内生真菌的菌落形态见图1．可见菌株LT 36的菌落为白色疏松粉粒状，全缘，菌丝白色；菌株LT 62的菌落为圆形、菌丝为浅灰色，基质为淡青色；菌株LT 46的菌落为圆形、全缘，菌丝白色．用透明胶纸粘片法经乳酸石炭酸棉蓝染色观察3株菌的菌丝和孢子形态，结果见图2，可见三株菌的菌丝发达，孢子椭圆形，其中LT 62的孢子较大，数量较多．

图1 内生真菌LT36、LT62、LT46的菌落形态

图2 内生真菌LT 36、LT 62、LT 46的菌丝和孢子形态

2.2 抗黑曲霉的活性代谢物筛选

分离纯化的菌株经玉米和大米培养基固体发酵30 d，乙酸乙酯法提取得到156个次级代谢产物，平板滤纸片法对黑曲霉（Aspergillus niger）进行活性初筛，筛选出13个具有抑制活性的内生真菌代谢物，其中抑菌圈半径≥1mm的代谢物有8个，以LT 46R、LT 46C、LT 62R和LT 36R的抑菌活性较好．复筛结果与初筛结果的活性基本一致，其抑菌效果见表1和图3，后续对相应的菌株进行菌种鉴定．

表1 内生真菌活性代谢物拮抗黑曲霉的复筛结果

图3 内生真菌代谢物LT 46R、LT 46C和LT 62R对黑曲霉的抑菌效果

2.3 菌种鉴定结果与聚类树构建

2.3.1 活性菌种的DNA提取和PCR扩增

对抗菌活性最好的3株菌株（LT 46、LT 62、LT 36）进行DNA提取、PCR扩增，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，结果见图4．3株菌株的扩增产物条带清晰，与Marker对比，PCR扩增产物约为500 bp，与引物ITS1/ITS4的预期扩增片段400-600 bp一致．

图4 活性内生真菌LT 46、LT 62、LT 36的PCR扩增图

2.3.2 ITS序列测定结果与系统发育树的构建

将3株菌的ITS序列分别提交至NCBI数据库中，对同源度较高的ITS rDNA序列进行Blast比对，构建的系统发育树见图5-7，可见LT 46、LT 62、LT 36分别与ConiolaRella属、Coniochaeta cipronana亚属、Daldinia属的亲缘关系最近，但没法鉴定到种．

图5 菌株LT 46基于ITS序列的系统发育树

图6 菌株LT 62基于ITS序列的系统发育树

图7 菌株LT 36基于ITS序列的系统发育树

3 讨论与结论

本研究分离到3株有抗黑曲霉活性的内生真菌LT 46、LT 62、LT 36，经ITS序列测序分别鉴定为ConiolaRella属、Coniochaeta cipronana亚 属 和Daldinia属，都没鉴定到种．值得关注的是，LT 46玉米和大米的发酵物对黑曲霉均有较高的拮抗活性，相较于其他菌株而言，LT 46更有望为化妆品新型防腐剂提供新型天然产物．

目前，从传统中医药及民间古方中发掘出用于美容化妆品的天然活性物质已经有数百种，其发明的组合物在防腐功能上具有协同增效作用，其抑菌效力明显高于化学防腐剂［14-15］．无添加防腐剂复合体系是天然、绿色化妆品研发的热点和趋势［16-17］，本研究希望通过对植物内生真菌的抑菌活性成分进行研究，开发出一种可以应用在化妆品中的天然植物来源的抑菌活性成分，下一阶段可考虑与多元醇复配，开发一种在化妆品中可以宣称无添加概念的复合抑菌防腐剂体系．