兰 旭，邓春青

甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)是一种有囊膜、分节段的单股负链RNA病毒，可使人、禽、猪、犬、马和水貂等在内的许多物种致病。根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的差异可分为不同的亚型，现已发现18种 HA (H1～H18)和11种 NA (N1～N11)[1]。物种不同，流行的亚型不同。单就HA而言，禽中几乎可以找到HA的所有类型(存在于蝙蝠中的H17和H18除外[1])；猪中主要流行H1、H2、H3[2]，同时也可见H4[2]、H6[3]和H9[4](局限于中国)等亚型；马中主要流行H3和 H7等亚型[2]，H9[4]已出现；犬中以H3亚型为主，H1、H5、H6、H9和H10等亚型也已出现[3,5]；而海洋哺乳动物曾分离到H1、H3、H4、H7、H10等亚型[2]。我国流行性感冒监测数据显示，目前感染人的甲型流感病毒主要为H1和H3亚型[6]。历史上只有H1、H2和H3亚型与人类大流行有关，但H4～H7、H9～H11亚型已跨越物种屏障引起零星感染，其跨物种机制仍有待进一步研究[4,7-8]。值得注意的是，H3亚型现已在大多数物种中出现并逐渐流行，其宿主范围最广。由此可见，HA蛋白与病毒的宿主嗜性高度相关，这也是HA蛋白备受关注的原因之一。另外，HA蛋白作用于流感病毒生命周期的启始，决定着病毒感染能否成功开启，对病毒本身意义重大。自1952年流感成为第一个实行全球监测的传染病起[9]，流感病毒HA蛋白的监测一直是该领域的研究热点。随着人们对HA蛋白认识的不断加深，抑制血凝素的药物也一直在推陈出新。

1 形态结构

HA蛋白是由基因组第4节段编码的一种同源三聚体抗原蛋白，具有Ⅰ型跨膜糖蛋白结构，其晶体结构于1981年被Wilson IA等[10]所解析。在外观形态上，HA蛋白可分为球形头部和杆状茎部。头部主要由HA1肽链组成，内含受体结合位点(Receptor binding site, RBS)和抗原位点(Antigenic site)。近年来，Zhu X等[11]认为，近乎所有的HA(包括H17)具有相似的RBS：呈浅桶状，边缘由HA1 155和3个HA1结构元素(190螺旋、130环和220环)围绕而成，底部由一些保守的芳香族残基(Y98，W153，H183和Y195等)构成。茎部靠近病毒囊膜，由HA1肽链的N、C末端及HA2肽链螺旋缠绕而成[12]。HA2蛋白C末端内含疏水序列和棕榈酸连接的质膜定位序列，N末端内含融合肽(Fusionpeptide，FP)[13]。RBS介导病毒与受体[唾液酸(sialic acid, SA)]特异性结合，通常人类流感病毒的RBS与SAα2, 6Gal结合，而禽流感病毒则与SAα2,3Gal结合；抗原位点可以刺激机体产生抗体；而FP则与膜融合相关。

2 功能作用

过去的研究表明，流感病毒的RBS与SA特异性结合，随后病毒粒子将通过网格蛋白和非网格蛋白介导的内吞作用或大吞噬作用，以内体(Endosome)的形式进入宿主细胞，内体中逐渐降低的pH值和逐渐升高的K+等信号将促进病毒的膜融合与脱壳[14-15]。最近有学者提出，RBS与SA的多价连接以及NA对该连接的水解作用(即HA-NA-SA三者间的平衡)将实现病毒粒子的运动游走，最终使其到达指定地点并成功吸附[16]；而甲型流感病毒NA蛋白的第二唾液酸结合位点则是HA-NA-SA平衡的重要决定因素[17]。另外，通过平衡HA-NA功能可以提升病毒粒子的复制功能，从而产生高增长的病毒毒株H7N9 CVV[18]。Wang Z等[19]也发现，HA1中某一氨基酸替换(G225E)将导致病毒复制更快，随后证明这与它们的组装和出芽效率不同相关。HA蛋白的功能作用已不再局限于病毒生命周期的“起始”，病毒生命周期的其他阶段，例如：复制、组装、出芽、释放和游走等也与其相关。当然，随着对HA蛋白认识的不断加深，一些未知功能仍有待进一步探索。

3 变异进化

由于宿主内环境的选择压力和病毒自身特性等因素的影响，HA蛋白遗传信息容易发生改变。个别点突变导致的抗原漂移，可引起流感的季节性流行，并决定着每年流感疫苗的组成成分。而点突变的积聚导致的抗原转变，则可能促进下一波流感大暴发。无论是流感病毒从一个宿主物种到另一个宿主物种的适应，还是其免疫逃逸的产生，甚至是关于平衡功能尚不稳定的HA-NA等，都与HA蛋白的变异进化密不可分。

3.1 单一位点的变异 一般而言，HA蛋白的点突变多发生在抗原位点及其附近和RBS边缘的残基上。对于那些能够稳定保持着的替换趋势，可能指示着病毒中的某些特定功能；而那些共有且保守的位点，则可被视作抗流感药物研发的作用靶标。HA蛋白的氨基酸位点变异具有多样性。此外，病毒的亚型不同，相应的位点变异存在差异。部分功能较为明确的氨基酸位点变异情况见表1。

表1 部分功能明确的HA蛋白氨基酸突变位点Tab.1 Partial functional mutations at amino acid sites in HA protein

在H1亚型中，D127E、S162T等替换可影响病毒的糖基化[24]；E190D[21]、D222G[24]、G225D[21]、R226Q[32]等替换是禽流感病毒为适应人宿主而发生的适应性改变(H3编号)；D222G[24]、D225G[30]等可使病毒具有双重受体特异性(H3编号)；T200A[32]、D222G(H3编号)[24]、D222N(H3编号)[7,24]、G225E(H3编号)[19]、E227A[33]等可增加病毒的致死率。李敏红等[34]曾指出，存在D222G或D222N替换容易导致重症(H3编号)。

在H3亚型中，D81N[21]可影响糖基化；Y98F[11]降低受体结合力，但可能增加其游走性；N121K[25]、T135K[25]、H156Q[35]等与免疫相关；而W222R(H3编号)[29]可影响病毒的感染力。另外，有学者曾指出[21]，为适应人宿主，禽流感病毒的HA蛋白发生了R62I、D81N、N92K、A144G、N193S、Q226L、G228S等替换(H3编号)。

在H5亚型中，126缺失[4]、T160A(H3编号)[7]等影响糖基化；K58I(H7编号)[20]、H103Y[20]、T315I[20]等替换可改变HA蛋白的稳定性；A138S[21]、T160A[7]、E186D[26-27]、Q222L[27]、G224S[27]、Q226L[21]、N227S/R[7]、G228S[21]等为为适应人宿主而发生的适应性改变(H3编号)；K58I(H7编号)[20]可产生双重受体特异性。

在H6亚型中，I55V[3]、L111F[3]、P186L[3]、A222V[29]、G228S[3]等替换为为适应人宿主而发生的适应性改变(H3编号)；S137N[3]、E190G[3]、A222V[29]等产生双重受体特异性(H3编号)。

在H7亚型中，K58I[20]、N94K[20]、A151T[23]、G219S[20](相当于H3编码中的第228位)、I/L226Q(H3编号)[20,31]影响HA蛋白的稳定性；E186D(H3编号)[26-27]、G186V(H3编号)[21]、G219S[20]、Q226I/L(H3编号)[20,31]、I368V[21]等替换为为适应人宿主而发生的适应性改变；G219S[20]、I/L226Q(H3编号)[20,31]等产生双重受体特异性；A125T[23]、A151T[23]可降低受体亲和力；G218E[18]可增加病毒的复制能力。Chang P等[22]分析表明，A125T、A151T和L217Q(相当于H3编码中的第226位)与免疫相关。另外，A143V(相当于H3编号中的第135位)、R148K与病毒的传播有关[31]，具体机制有待进一步研究。

在H9亚型中，I155T[4]、H183N[4]、A/I190T/V/D/E[4,28]和Q226L[4]等替换为为适应人宿主而发生的适应性改变(H3编号)；而G72E、G73K、S127N、S132A、D135G、N183D、A180V(相当于H3编号中的第190位)、L216Q(相当于H3编号中的第226位)、N221D、N238D和V239I等替换将使A/H9N2转变为逃逸突变体[36]。

值得一提的是，Q226L和G228S(H3编号)作为病毒嗜性向哺乳动物方向转移的标志性替换，在众多亚型的HA蛋白上都曾出现过，目前前者涉及H2、H3、H5、H7和H9等亚型，后者涉及H2、H3、H5和H7等亚型[21]。这或许与其特殊的位置有关(H3亚型中，两者既落在HA的抗原表位D上，又落在其RBS的220环内)。何军等[37]发现，安徽省2013-2018年分离的外环境禽源A/H9N2的HAs在183、189、190、226和227等多个位点均发生突变，这些突变的累积效应使其逐渐向适应哺乳动物方向进化(H3编号)。结合表1及近期相关文献资料我们认为，在进化过程中相较于153、194、195等位点，135、186、190、222、225、226、227、228等位点相对容易发生突变(H3编号)，且对宿主嗜性影响较为显著。另外不难发现，RBS的220环上存在较多的易突变位点，而且部分突变还与双重受体特异性的产生相关；Peacock等[38]也曾指出，220环氨基酸缺失的流感病毒(特别是在H5、H7或H9亚型中)与其他毒株相比可能构成更高的人兽共患病风险，故应警惕。

3.2 变异间的联系发展 一些研究表明，HA蛋白内不同位点间的替换是具有相关性的。当Q226L与G228S突变共存时，HA蛋白对SAα2, 6Gal的结合明显增加[39]。N224K和Q226L突变协同可改变受体结合偏好，产生空气传播的H5，但这可能还与HA上N158D和T318I替换相关[40]；Wang Z等[19]进一步研究发现HA-N224K/Q226L/T318I突变可使含有来自pH1N1/09病毒7个基因和来自H5N1病毒HA基因的重组病毒获取在雪貂之间传播的能力。另外，A/H7N9 HA上的A125T、A151T和L217Q突变可以在传代培养中同步保持[22]；在进一步的研究中Chang P等发现，A125T+A151T突变可完全消除病毒对SAα2, 6Gal的结合[23]。

各病毒蛋白间的位点变异同样具有内在联系。PB1中的H99Y、HA中的H110Y和T160A被认为对病毒在雪貂中的呼吸道传播是必不可少的(H3编号)[40]；PB2-701N和HA-260M影响着病毒嗜性向哺乳动物方向转变(H3编码)[2]。当与适当的NA一起考虑时，HA的第180位残基(H9编号，相当于H3编号的第190位)是一个很好的哺乳动物适应的分子标志物[28]。在人源A/H9N2分离株中，HA(183N、190T/V、227Q)、PB2(588V、627K/V、701N)和PA(356R、409N)具有关联性，且是关键的哺乳动物适应标记(H3编号)[4]。最近还有研究显示[41]，甲型流感病毒NA蛋白的第二唾液酸结合位点突变驱动血凝素补偿性突变，可能增加人兽共患的潜力。故HA位点的变异不仅在蛋白内部具有协调性，而且其还与NA、PA、PB1和PB2等蛋白的变异相关，进而共同影响着病毒的生物学特性。

4 药 物

血凝素主要参与病毒生命周期的吸附与膜融合。对于其药物的研究，在认识的早期阶段，研究者们常把目光投注于HA的球形头部，通过影响RBS及抗原位点来抑制血凝素的功能。现今，研究者们发现，相较于HA球形头部，茎区的某些序列和结构是高度保守的，尤其是内含的融合肽(HA蛋白中最保守的区域)，这使得它成为一个全新的有吸引力的靶点。目前，许多抑制血凝素药物的研究较前有所进展，而作用对象大多都集中在HA茎区这一功能区域，例如：一些广泛性中和抗体及大部分膜融合抑制剂等。

4.1 中和抗体 MEDI8852由MedImmune研发，靶向HA茎区，通过互补决定区(complementarity-determining regions,CDR)协调运动，结合至茎区高度保守的表位(涵盖融合结构域中的疏水槽和大部分融合肽)，从而抑制HA介导的膜融合过程，也可与HA前体结合来阻断HA0的裂解[43-44]。对所有IAV均有抑制作用，已进入Ⅱ期临床开发[45]。

MHAA4549A由Genentech研发，通过结合HA茎区上某些高度保守的表位来阻止融合肽的展开，进而阻断膜融合，同时促进依赖抗体的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和依赖抗体的细胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)，最终实现抗病毒作用[43,46]。可以中和所有已知的人类甲型流感病毒毒株，在Ⅱa期研究中确定了预计的人体有效剂量(45 mg/kg)[47]。

CR6261和CR8020由Crucell[43]研发，同样靶向HA茎区。在系统遗传进化方面，HA分为2个进化组：组1(包含H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18)和组2(包含H3、H4、H7、H10、H14、H15)[48]。CR-6261[49-50]识别HA1/HA2膜近侧茎中高度保守的螺旋区，主要与HA2-A螺旋相互作用，但也与HA1-N端的部分残基接触；其可能通过稳定融合前状态来阻断与膜融合相关的构象重排而发挥抗病毒作用；作用于第1组，目前已进入Ⅲ期临床研究。而CR-8020作用的表位残基则位于融合肽的关键区域(HA 21-25)和HA2的螺旋帽状区(H3编号)，其通过分离融合肽并阻止其在低pH下的释放来阻止融合，同时还可能通过抑制宿主蛋白酶裂解HA0来干扰融合[51]；对第2组的HA有抑制作用，也已进入临床试验阶段[50]。两者互为补充，联合治疗可拓宽对宿主的保护范围。

VIS410由Vistera研发，靶向HA茎区，主要作用于其上一高度保守的A螺旋区域，通过与HA的茎区结合从而阻止膜融合过程来终止病毒复制周期，在体外试验中还表现出ADCC作用[52]。可广泛中和流感病毒第1组的H1、H2、H5、H6、H9和第2组的H3、H7等亚型，已进入Ⅱ期临床研究[50,52-53]。另外有报道显示[54]，在GISAID数据库中，0.06%的HA序列中已鉴定出对VIS410体外敏感性降低的变异体(HA2 N53D)。

有待进一步研发的抗体(靶向部位)还包括：CH65(RBS)、C05(RBS)、5J8(RBS)、F045-092(头部)、27F3(茎区)、CR9114(茎区)、FI6v3(茎区)、F10(茎区)、PN-SIA28(茎区)、CT-P27(茎区)等。

4.2 受体结合抑制剂 DAS181(Fludase)[45]是一种重组的唾液酸酶融合蛋白,通过除去宿主细胞表面的唾液酸，来抑制HA蛋白的吸附过程。其对季节性甲、乙型流感病毒有抑制作用，对小鼠H5N1病毒感染有防治作用，对耐奥司他韦的H1N1临床分离株也有效，目前处于Ⅲ期临床研究[55]。此外，还有Cyanovirin-N、FluPep等有待进一步研发。

4.3 膜融合抑制剂 阿比朵尔是一种吲哚类化合物，通过稳定HA的结构来阻断HA介导的融合过程，对甲型、乙型流感病毒毒株都具有抑制作用[47]。目前，美国正在进行Ⅳ期临床研究，我国已上市[56]。硝唑尼特(nitazoxanide，NT-300)是一种噻嗪类广谱抗病毒药物，在体内转化为活性形式—替唑尼特 (tizoxanide)，作用于翻译后阶段，通过阻断HA糖基化等影响HA成熟、干扰HA0的胞内转运[45]。其对多种人和禽流感病毒(H1N1、H3N2、H5N9、H7N1等)均有活性，目前处于Ⅲ期临床试验阶段[50,57]。 其他噻唑类化合物还包括：RM-5014，唑沙尼特，RM-5038等[50]。同时，TBHQ、苯磺酰胺类化合物(RO5464466和RO5487624)、MBX2546和MBX2329、CBS1117和H84T等目前也在研发中。

4.4 天然小分子物质 大自然中还存在一些对血凝素有抑制作用的天然小分子物质，例如：赤芍、白芍、金缕梅及牡丹皮等中的鞣质化合物(五没食子酰基葡萄糖、单宁酸等)[58]、接骨木莓和金荞麦等中的黄酮类化合物(甲基槲皮素和二氢杨梅素等)[59-60]、姜黄中的多酚化合物(姜黄素)[61]、穿心莲内酯磺化物[62]、板蓝根水提物S-03[63]、PPa[64]、urumin[65]、EGCG[66]、spiromastilactones[50]、Stachyflin[55]、OA-10[66]等。

5 小 结

目前，对HA 蛋白的研究主要集中在2个领域，一个与头部相关，另一个则与茎部相关，前者主要涉及IAV跨物种传播的机制研究，后者则侧重于相关药剂的研发。最近，个别学者强调了HA-NA间的平衡关系，同时指出两者具有一定的适应性才能稳定传递，这或许就解释了为什么“H”和“N”虽然可以自由搭配但两者组合并不是完全随机；对于那些尚未出现过的HxNx，当下或许因为分子间的不平衡性和种群障碍而被限制，但却是我们未来警惕的方向。Sun X等[4]也曾指出，H9N2病毒的内部基因具有较高的相容性，引起人类感染的H5N1、H5N6、H7N9和H10N8病毒都从其内获得了内部基因，这就意味着H9N2病毒扮演着内部基因供体的角色。因此，IAV的广泛分布将导致病毒的重新分类和不同基因型的产生，这在很大程度上增加了人兽共患病的风险。其次，抗流感病毒药物的耐药形势变得越来越严峻，例如：M2离子通道抑制剂因普遍耐药已不推荐用于临床，神经氨酸酶抑制剂的耐药株及新发耐药位点与日俱增，上市不久的巴洛沙韦的耐药株也已出现[67]。在未来，病原学监测、流行病学调查、生物学特性的剖析以及相关新药的研发仍然是该领域的重点。随着相关数据库的健全以及抗流感药物的不断充实，或许有一天我们可以根据监测信息的回报，通过对药物的规律性使用来主动调控甲型流感病毒的变异方向，进而减少一些突发事件的产生，也让公卫大环境更加稳固。

利益冲突：无