孙初阳，崔 磊，潘家兴，王如敏，马 焱，李丹丹

流感病毒是流行性感冒的病原体，主要以呼吸道为侵入门户，发病率高、人群普遍易感,可在短时间内引起人群大规模流行，是常见的急性呼吸道传染病。流感病毒属于正黏病毒科，流感病毒属，可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)4型[1]。甲型流感病毒易变异，人群对新的亚型普遍缺乏免疫力，易引起世界范围的传播和大流行，导致严重的疾病负担，被WHO实行全球范围监测[2]。

A(H1N1)pdm09最早被称为猪源H1N1流感病毒(Swine Origin Influenza A(H1N1)Virus, SOIV)。2009年在美国和墨西哥引起暴发，并引起全球性流感大流行疫情[3]，随后A(H1N1)pdm09亚型季节性流感流行株，继续在人群中流行。海南省2009年6月报告首例A(N1N1)pdm09亚型流感病毒输入性确诊病例，并于9月初首次报告省内本地确诊病例[4]，至今A(N1N1)pdm09亚型流感病毒在海南省已有10年流行史，很少见其遗传变异和演化相关方面研究的报道。为进一步了解海南省A(HIN1)pdm09亚型流感病毒的遗传变异情况和生物学特点，本文选取14株2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒进行HA和NA基因序列分析，为阐明病原体的分子变异、流行变迁和防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 A(HIN1)pdm09亚型流感病毒来源 14株A(HIN1)pdm09亚型流感病毒来自2019-2020年海南省流感参比中心和4家流感监测网络实验室。哨点医院将采集的标本送至对应的流感监测网络实验室，核酸检测阳性的标本，接种MDCK细胞和(或)9～11日龄SPF鸡胚进行病毒分离培养，培养物经血凝(HA)和血凝抑制(HI)实验鉴定。跟据《全国流感监测技术指南(2017年版)》中规定流感监测年度，本实验流感监测年度时间为2019年4月1日至2020年3月29日。

1.2 A(HIN1)pdm09亚型流感病毒的序列测定和分析 血凝滴度≥8的病毒培养物委托上海伯杰生物科技有限公司进行基因序列测定。MEGA 10.1.8软件对测定序列与参考株进行比对，采用邻位归并法(Neighbour-joining)分别构建HA和NA基因进化树。从全球共享禽流感数据倡议组织(GISAID)数据库下载已公布的国内其他省市代表株、北半球疫苗株和国际代表株为参考毒株，DNASTAR7.0.1软件中MegAlign用于序列核苷酸和氨基酸同源性分析。

1.3 A(HIN1)pdm09亚型流感病毒的抗原性分析

抗原性分析使用标准参考抗原和标准参考抗血清由中国疾病预防控制中心提供，标准参考抗血清经RDE(日本生研)处理，人“O”型血制备红细胞悬液,抗原性分析中红细胞凝集(HA)和红细胞凝集抑制(HI)试验及标准参考抗血清处理过程详见《全国流感监测技术指南(2017年版)》。

1.4 试剂 病毒RNA提取试剂盒购于QIAGEN公司，RNA提取过程参照RNeasy Mini Kit试剂盒说明书。Real-time RT-PCR检测试剂盒购于上海之江生物科技有限公司，反应体系、反应条件和结果判定参见说明书。SPF鸡胚购于济南斯帕法斯家禽有限公司。

2 结 果

2.1 海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒监测情况 2019年4月至2020年3月海南省流感监测网络实验室分离不同型别流感病毒共489株，A(H1N1)pdm09亚型、H3N2亚型、B型Victoria分别为24、145、320株。海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒与H3N2、B型Victoria亚型流感病毒共同流行，其中H3N2亚型和B型Victoria为优势毒株，A(H1N1)pdm09亚型流感病毒在人群中散发流行。

2.2 海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒HA基因同源性分析 14株A(H1N1)pdm09亚型分离株与WHO推荐的北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018(2019-2020)、A/Michigan/45/2015 (2017-2019)、A/California/07/2009(2010-2016)进行核苷酸和氨基酸同源性分析显示(表1)，海南省流感病毒分离株之间 HA 基因核苷酸同源性范围是98.1%～100%，氨基酸同源性范围是97.7%～100%。与疫苗株A/California/07/2009 HA基因核苷酸同源性范围是95.9%～96.8%；氨基酸同源性范围是95.1%～96.5%。与疫苗株A/Michigan/45/2015 HA基因的核苷酸同源性范围是97.5%～98.6%；氨基酸同源性范围是97.5%～98.8%。与疫苗株A/Brisbane/02/2018 HA基因核苷酸和氨基酸同源性范围分别为98.5%～99.1%和97.7%～99.1%。

表1 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分析Tab.1 Analysis of HA gene nucleotide and amino acid homology of A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus

2.3 海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒HA基因特性分析 本年度按时间和地区分布选取14株A(H1N1)pdm09亚型流感病毒进行HA基因序列测定并构建核苷酸进化树(图1)。HA基因进化树显示，海南分离株与WHO推荐的疫苗株A/Brisbane/02/2018(2019-2020)及国内其他省市代表株在同一分支上，依据WHO命名方式[5-6]属于6B.1分支。进化树上海南分离株与2019年国内代表株进化关系最近，在同一簇上，2016-2017年国内参考株虽然与海南分离株在同一分支上，但单独成簇。疫苗株A/California/07/2009(2010-2016)和国外参考毒株与海南分离株分属不同分支进化关系较远。与疫苗株A/California/07/2009，A/Michigan/45/2015和A/Brisbane/02/2018相比，14株海南分离株氨基酸在S162N、K163Q、S164T有共同的变异位点，与疫苗株A/Brisbane/02/2018一致，S162N位点的变异增加了一个潜在糖基化位点[5]。另外有6株分离株189位氨基酸发生Q189E突变，1株N156K氨基酸位点发生变异(表2)。

表2 A(H1N1)pdm09亚型流感病毒血凝素基因(HA)抗原决定簇位点变异Tab.2 Antigenic determinant site variation of hemagglutinin in A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus

注：E.鸡胚株；●海南省分离株；■疫苗株图1 2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒HA基因进化树Fig.1 Phylogenetic tree for HA gene in A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus from Hainan Province during 2019—2020

2.4 海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒NA基因序列分析和进化分析 海南分离株构建NA基因核苷酸进化树与HA基因核苷酸进化树基本一致，分离株NA基因与疫苗株A/Brisbane/02/2018在相同分支6B.1上。流感病毒对神经氨酸酶抑制剂敏感性的改变一般是由NA基因中关键氨基酸位点突变引起[7]。与疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，本次研究中所有A(H1N1)pdm09亚型流感病毒中与神经氨酸酶抑制剂耐药相关的9个关键氨基酸位点E119、Q136、Y155、I223、S247、H275、R293、N295、Q313均未发生变异。

2.5 海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒抗原性分析 根据HI效价8倍(含8倍)差异判断[8]，14株海南分离株中，13株为A/Brisbane/02/2018类似株，1株为A/Brisbane/02/2018低反应株。

3 讨 论

海南省2009年9月初首次报告省内A(H1N1)pdm09亚型流感病毒确诊病例以来，A(H1N1)pdm09亚型流感病毒10年间呈持续散发流行态势，已经成为季节性流感主要亚型之一，为防止其再次引发疫情、危害人类健康和造成社会经济损失，应继续加强A(H1N1)pdm09亚型流感病毒监测工作。

甲型A(H1N1)pdm09亚型是新的重组型流感病毒，由于新亚型流感病毒表面抗原HA及NA易发生变异，可使病毒跨越宿主屏障，2009年引起本世纪首次流感大流行[9]。A(H1N1)pdm09亚型流感病毒基因组包含人、猪和禽流感病毒基因片段,表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸(NA)基因分别来源于古典猪支系及欧亚猪系[10-11]，HA基因可凝集多种动物红细胞，与细胞表面病毒特异性受体结合，刺激机体产生中和抗体等特性[12]。流感病毒有无感染性与HA前体(HA0)水解成HA1和HA2 2条多肽有关,不同亚型流感病毒HA裂解位点的氨基酸数量不同，例如人H1亚型病毒只有1个精氨酸残疾(R)裂解位点。本次研究的A(H1N1)pdm09亚型分离株裂解位点中氨基酸序列均呈现为 V321PSI324QSR↓GLFGA，即 HA 裂解位点中只含单个碱性氨基酸 R，附近未见多个连续碱性氨基酸，属于低致病性流感病毒特征[13]。

HA基因具有高度变异性[14]，抗原位点氨基酸的变异与流感病毒的抗原性密切相关。A(H1N1)pdm09亚型流感病毒HA1有 4 个抗原决定簇，即 Ca、 Cb、 Sa 和 Sb，其中Ca又分为Ca1和Ca2，共 32个抗原位点[15-16]。海南分离株共同的氨基酸变异位点NQT162-164位于抗原决定簇Sa上，变异位点E189位于Sb抗原决定簇，抗原性分析结果比对中这13株分离株是疫苗株(A/Brisbane/02/2018)的类似株，抗原性无明显差异，NQT162-164和E189氨基酸位点变异均未影响其抗原性；Sb抗原决定簇上K156位点变异的分离株为低反应株，推测K156位点的变异使A(H1N1)pdm09亚型流感病毒的抗原性差异显著。一般HA1蛋白分子2～3个抗原决定簇上发生4个以上氨基酸位点替换具有流行病学意义[2，17]，海南分离株中7株发生2个抗原决定簇(Sa和Sb)4个氨基酸位点变异，发生抗原漂移的分离株占50%，其余分离株未发生HA蛋白抗原漂移。根据流行株HA基因抗原位点变异情况，WHO推荐2019-2020年北半球流感疫苗组份时，将6B.1分支疫苗株A/Michigan/45/2015(2017-2019)更新成同一分支的A/Brisbane/02/2018，疫苗株匹配性高有更利于A(H1N1)pdm09亚型流感病毒的防控。

海南分离株HA蛋白在第10、11、23、87、276、287、481、540位保持较稳定的糖基化位点，仅在S162N位点增加了一个潜在糖基化位点，一般认为糖基化位点的改变或数目的增减会影响病毒的抗原性或对病毒的稳定性、传染性和致病性产生一定的影响。流感病毒主要通过抗原位点上氨基酸变异和HA糖基化的方式逃避宿主中和抗体的免疫压力，使疫苗不能对机体产生有效的保护，从而造成疫苗免疫失败[18]。

NA糖蛋白由RNA节段6编码，其主要功能是清除唾液酸，破坏宿主细胞上HA受体，有利于病毒的释放。NA酶活性中心序列高度保守，目前NA抑制剂研究主要是针对NA酶活性中心和周围辅助的氨基酸位点[19]。NA氨基酸位点中275和195位点的变异将导致A(H1N1)pdm09亚型流感病毒对神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦敏感性降低[20-21]。2019-2020年海南分离株NA基因无氨基酸位点突变，对神经氨酸酶抑制剂敏感，磷酸奥司他韦敏对A(H1N1)pdm09亚型流感病毒仍是有效治疗药物。

海南分离株之间氨基酸和核苷酸序列高度同源，说明本地分离株之间变异小亲缘关系近。在HA基因和NA基因进化分析中，国内参考株在HA基因和NA基因进化树中基本按年份进化分布，没有呈现明显的地理分布,说明海南分离株与国内代表株年份差异大于地域差异。

综上所述，2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒与WHO推荐的疫苗株同源性高，流感疫苗和磷酸奥司他韦敏能够对海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒起到有效的预防和治疗作用，但仍需加强A(H1N1)pdm09亚型流感病毒的监测，及时掌握分子流行病学资料，为A(H1N1)pdm09亚型流感病毒防控提供科学依据。

利益冲突：无