虞冰，刘莉，吾建祥，杨德毅，马婧妤

(金华市农产品质量安全中心，浙江 金华 321017)

氟喹诺酮类药物(FQs)是一类全合成广谱抗菌药，广泛用于人和动物的疾病治疗，具有高效、广谱、低毒等特点，在畜牧养殖业中广泛用于预防和治疗动物疾病[1-2]。FQs药物长期使用会于动物体内蓄积，影响到人类的健康，会对人体的心血管系统及中枢神经系统造成不良影响，可导致呼吸肌无力，重症肌无力，甚至危及生命[3]。动物性食品中低浓度的FQs残留易产生耐药性菌株，致使有效使用剂量增加。本文借鉴标准规定和相关文献的前处理方法[4-7]，建立高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，用于同时测定水产品中15种FQs残留，在试样的提取、高效液相色谱和质谱的检测条件方面进行优化，旨在为氟喹诺酮类兽药残留检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

水产品(鲫鱼)采购于金华市各地市养殖企业。98.48%氟罗沙星、95.71%氧氟沙星、97.49%诺氟沙星、97.51%依诺沙星、92.31%环丙沙星、99.90%恩诺沙星、99.42%洛美沙星、99.90%丹诺沙星、97.50%奥比沙星、96.80%双氟沙星、85.92%沙拉沙星、99.00%司帕沙星、98.20%噁喹酸、99.30%氟甲喹、92.19%培氟沙星均为标准品(北京振翔科技有限公司)；无水硫酸钠、正己烷均为分析纯；乙腈、甲酸为色谱纯。试验用水(一级水，电阻率为17.65 MΩ·cm)

LC-MS/MS8050超高效液相色谱-串联质谱仪(日本岛津公司)；高速离心机(日本日立公司)；BSA2202S电子天平(德国赛多利斯公司)；BSA224S电子天平(德国赛多利斯公司)；涡旋振荡器(德国IKA)；均质器(新锐精仪)；旋转蒸发仪(Heidolph)；台式离心机(上海安亭)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为C18柱，MGⅡ，2.1 mm×150 mm，5 μm，或相当者；流动相A相为0.1%甲酸溶液(含5.0 mmol·L-1醋酸铵)，B相为甲醇，C相为乙腈；流速为0.20 mL·min-1；柱温为室温；进样量10 μL；洗脱方式为梯度洗脱。梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱流动相洗脱条件

1.2.2 质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源(ESI)、正离子模式；喷雾电压为4 500 V；雾化气压力为12 L·min-1；辅助气流量为2 L·min-1；离子传输管温度350 ℃；源内碰撞诱导解离电压为10 V；扫描模式：选择反应监测(SRM)，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量(表2)。

表2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量

1.2.3 储备液配制

称取99.90%恩诺沙星、99.90%丹诺沙星各10.01 mg，98.48%氟罗沙星10.15 mg，95.71%氧氟沙星10.45 mg，97.49%诺氟沙星10.26 mg，97.51%依诺沙星10.26 mg，92.31%环丙沙星10.83 mg，99.42%洛美沙星10.06 mg，97.50%奥比沙星10.26 mg，96.80%双氟沙星10.33 mg，85.92%沙拉沙星11.64 mg，99.00%司帕沙星10.10 mg，98.20%噁喹酸10.18 mg，99.30%氟甲喹10.07 mg，92.19%培氟沙星10.85 mg。

1.2.4 样品前处理

称取(5±0.02)g试样，于50 mL具塞离心管中。加入5 g无水硫酸钠，加入钢珠，再加入20 mL乙腈，放入均质器内匀浆。以4 000 r·min-110 ℃离心5 min，取上清液于50 mL梨形瓶中。残渣中再加入20 mL乙腈，重复提取1次，合并2次提取液。在梨形瓶中加入5 mL异丙醇，用旋转蒸发仪于50 ℃水浴浓缩蒸发至干。准确加入2 mL流动相(甲醇∶水=1∶1)，再将梨形瓶进行超声溶解残渣，将混合液转移至5 mL离心管中，加2 mL正己烷至梨形瓶中，超声溶解，转移至上述离心管。将5 mL离心管中的混合液涡旋，以4 000 r·min-1离心5 min，去上层液体。如果试样分层不明显，油脂浑浊，再加1 mL正己烷，重复净化，直至下层液体澄清。取下层清液，过0.2 μm滤膜，装入进样瓶，并在进样瓶上写上编号，用液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.5 计算与表述

计算氟喹诺酮类兽药残留量公式:

Xi=ciV/m。

式中，Xi为样品中喹诺酮类药物残留的含量(μg·kg-1)；ci为样品制备液中氟喹诺酮类药物残留的浓度(ng·mL-1)；V为最终定容体积(mL)；m为样品称样量(g)。保留3位有效数字。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、线性范围和检出限

取适量的标注储备液，用流动相初始溶液对15种氟喹诺酮类药物标准储备液进行稀释，形成系列浓度为2、5、10、20、50、80 ng·mL-1的标准工作溶液。浓度从低到高依次进样测定，每个浓度进样3次。以离子色谱峰面积为纵坐标、相应的溶液浓度为横坐标作图，得到相应氟喹诺酮类药物的标准曲线。15种氟喹诺酮类药物在5～80 ng·mL-1浓度范围内，呈良好线性关系，线性回归方程、相关系数见表3。

表3 15种氟喹诺酮类药物标准曲线及相关系数

将适量的标准工作溶液加到空白试样中，按照1.2.4节的试验方法处理以后，用UPLC-MS/MS进行检测。通过计算本试验方法，检出限(LOD，S/N>3)为1.0 μg·kg-1，定量限(LOQ，S/N>10)为2.0 μg·kg-1。

2.2 精密度和回收率

量取20、100、200 μL对照工作液加到5 g样品中，添加浓度3个平行，每份样品测定3次，取平均值，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。由表4可知，试样中15种氟喹诺酮类兽药添加样品的回收率在77.33%～100.30%之间。回收率和RSD均达到良好要求。

表4 禽蛋中8中氟喹诺酮类兽药回收率和标准偏差

3 小结

本文建立了水产品中15种氟喹诺酮类兽药残留检测的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定方法，该方法与普通液相色谱法相比，定性定量更准确，检测速度提升，分离时间缩短，方法的灵敏度和分离度及重现性较好，稳定性高，满足水产品中氟喹诺酮类药物残留分析的检测要求，同时溶剂用量大为减少，降低了分析成本，使检测效率得到提升，可以用来监控水产品中15种氟喹诺酮类药物的残留量。