谢小波，邱海萍，陈鸿才，王艳丽，郑家祥

(1.浙江省农业科学院a园艺研究所，b植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310012；2.浦江县农业农村局，浙江 浦江 322200；3.浦江长丰果园种植有限公司，浙江 浦江 322200)

浦江桃形李属中国李(PrunussalicinaL.)曾是浙江名果，主产于浙江浦江县。其果顶尖圆，外形似桃，因而得名。浦江桃形李一般8月上中旬成熟，成熟时果粉较厚，果皮黄绿，果肉淡黄色，味甜微酸，略脆，口感上乘。经低温贮藏1周以上的果实，外观色泽金黄，口感松软，汁水丰富，带香气，甜度增加，非常爽口。浦江桃形李可溶性固形物含量较高，通常在15%以上；果形大，一级果单果重一般在100 g以上，普通果实也都在80 g以上；丰产性好，需要疏果[1]。

浦江桃形李一个重要特征为果实内部有空腔，该空腔位于核尖周围，在果实膨大过程中开始出现，随着果实发育而增大。空腔表面粗糙，带棕黄色，其形态与离核腔面较为光滑特性有所不同，空腔形状一般呈不规则星形。浦江桃形李不同果实的核、肉分离程度不同，严重的约有2/3核表面与果肉分离，小部分果实除核尖一端有空腔外，在核底部也还会出现较小空腔。浦江桃形李无论外形和内部空腔形态都与福建的木奈李非常相似，应属同一类型[2，3]。

浦江桃形李果实内空腔形态及其对品质的影响以往少有报道，本文特此对该特性进行研究，现将有关结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 材料

以浦江桃形李不同发育时期的果实为研究材料，以成熟期浦江桃形李果实作为空腔内微生物培养材料。

1.2 方法

1.2.1 不同发育时期空腔动态变化

将不同发育时期的浦江桃形李果实从中间切开，观察近核周围空腔形成情况。用游标卡尺测量果实的纵、横径及果实空腔纵、横径。

1.2.2 果肉切片番红固绿染色

果实采样后，将需要切片观察的组织用2.5%戊二醛固定，于4 ℃保存，用于石蜡切片。固定后的样品进行石蜡切片制作，切片机为Leica RM2016，切片厚度设为4 μM。然后分别进行番红固绿染色和间苯三酚染色，再进行显微成像观察。

番红固绿染色方法。依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、无水乙醇Ⅰ10 min、无水乙醇Ⅱ 10 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min、蒸馏水分别清洗，进行切片脱蜡；脱蜡后，先在1%番红染液中染色1～2 h，用水洗去多余染液，分别放入50%、70%、80%梯度酒精脱色各1 min；然后将切片放入0.5%固绿染液中染色30～60 s，无水乙醇I中脱色30 s、无水乙醇II中脱色1 min；最后切片于60 ℃烤箱烤干，并于二甲苯透明5 min，中性树胶封片。

切片全景扫描成像方法和分析。番红固绿染色切片用扫描仪Pannoramic MIDI(匈牙利3D HISTECH公司产品)扫描，按照说明书操作，扫描成像文件包含了完整组织信息。图像文件用CaseViewer软件读取并可随意放大至1 000倍。

1.2.3 果实空腔内微生物培养与分离

无黑心果微生物培养。将预先冷藏的成熟浦江桃形李果实先用流水冲洗干净，再用3%H2O2消毒、漂洗3 min，无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸干表面水分。然后用无菌手术解剖刀将近核果肉切成0.5 cm×0.5 cm小块，之后将消毒材料分别接种到PDA培养基中，每培养皿接种4块或3块，重复3次，果核单独接种。在28 ℃恒温培养3～5 d，观察组织块外围的菌落培养情况。

黑心果微生物培养。前处理方法与无黑心果微生物培养相同。若有菌落形成，观察其形态、颜色的差异及菌丝形状等。采用菌丝末端分离法[4]，分别挑取不同菌落边缘菌丝转接于PDA培养基平板上进行纯化培养，观察记录菌落的形态。纯化后采用斜面保藏方法置于4 ℃下保藏，定期检查。

1.2.4 黑心果实内生真菌的分子生物学鉴定

将黑心果分离到的内生真菌在PDA培养基上培养一段时间后，从平板上刮取约0.1 g菌丝体，置于1.5 mL灭菌离心管中，按照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并以此为模板，通过通用引物ITS1和ITS4对菌株rDNA-ITS区域进行扩增。PCR反应体系(30 μL体系)：PCRmix7.5 μL，ITS1和ITS4各1.2 μL，模板DNA1.6 μL，双蒸水补足30 μL。PCR扩增条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶(DuRed核酸染料)电泳检测，将扩增后的DNA交上海生工生物技术有限公司进行测序。测序获得的ITS序列通过BLAST比对，根据同源性相似度差异，采用MEGA5邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，对分离菌株与数据库中登录的近源菌株系统发育树关系进行分析。

2 结果与分析

2.1 果实空腔发育动态

图1显示，将不同发育时期的浦江桃形李采样后对半剖开观察表明，浦江桃形李约在花后74 d左右开始出现核、肉分离现象，即在果实开始膨大初期，随着果实发育，空腔会逐渐变大，到成熟时期(一般至8月上中旬)1/2～2/3核表面会发生核、肉分离现象，同时空腔内常伴有白色透明结晶物沉积。此外，空腔大小与果形大小有关，一般果形小空腔也变小。不同果实空腔形成时间存在差异。

a—花后68 d；b—花后74 d；c—花后81 d；d—花后99 d；e—花后106 d；f—花后137 d。

2.2 果实纵横径比与果实空腔大小的关系

测量多点生长浦江桃形李成熟果实纵、横径，果实纵、横径分别为57.9±4.4和54.6±3.3 cm，纵、横径比值为1.06±0.05；果实空腔纵、横径分别为17.9±8.6和22.1±6.4 cm。分析浦江桃形李果实纵横比与空腔纵、横径的相关性，相关系数分别为0.518和0.505，检验均达极水平显著。分析结果表明，浦江桃形李果实纵横比与其空腔大小成正相关。

2.3 果肉细胞显微结构观察

采样空腔形成后的浦江桃形李果实，与其相邻种植无空心现象的芙蓉李作比较，对靠近核尖部位的果肉进行切片，并用番红固绿染色，然后对果肉细胞进行显微观察。图2显示，靠近空腔的浦江桃形李果肉细胞壁基本没有被染成红色，说明其细胞没有明显木质化现象。这与鲜食浦江桃形李的口感一致，即其果实空腔并不影响食用品质，成熟时果肉口感仍然表现细腻、松脆，存放后松软、多汁。

图2 浦江桃形李果肉细胞显微结构观察

2.4 果实空腔微生物培养与分离

将采样的成熟时期浦江桃形李果实表面消毒后，对暴露在空腔中的果肉、果核进行微生物培养。图3表明，健康果实并未培养出微生物，但同样果面完好的黑心果实培养出微生物。

图3 浦江桃形李空腔内物生物培养

经初步鉴别，黑心果中分离到9种可能的致病性真菌，分属Fusariumfujikuroi、Botryosphaeriadothidea、Moniliniafructicola、Phomopsissp等4个种。

3 讨论

无论是黏核还是离核的李子品种，均发现部分果实存在不同程度的空腔现象，如浙江另一个著名地方李子品种嵊县桃形李中也时有发现，但此类果实的空腔往往为个别现象，同品种中多数果实没有空腔。因此，这类品种的果实空腔可能受生长环境影响。但浦江桃形李果实空腔普遍存在，若果形较小，则空腔相对也小；果形大，空腔则大，且空腔呈不规则星形。空腔纵、横径长度少则十几毫米，多则三十几毫米不等，其空腔比一般的李子品种都大。这种空腔李子在一定程度上影响其市场销售，不明情况的消费者会误认为是坏果。更广泛种植的木奈李(包括油木奈和青木奈)也面临类似情况[5]。

浦江桃形李不同地理环境品质有一定的差异[6]。因此，要在更适宜的土壤立地条件下种植，发挥其优良口感特性，通过栽培措施培育出更好的品质，弥补其存在空腔这一性状的不足，同时加强地方特色品种宣传，让更多消费者了解其特性。目前已开展了海藻肥的试验，初步结果表明，有较好效果，后续将继续开展试验，总结出配套的栽培措施。