罗晓锋，周建金，叶炜，乔锋，廖承树

(三明市农业科学研究院，福建 沙县 365500)

2015年版《中国药典》规定，中药重楼为百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎[1]。七叶一枝花的主要有效成分是甾体皂苷，其皂苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元[2]。现代药理研究表明，七叶一枝花具有抗肿瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒、避孕等作用，其良好的疗效被众多的制药工业应用，是云南白药、宫血宁、热毒清等重要中成药的主要成分，用途极为广泛[3-5]。

由于近年重楼药材供需矛盾突出，七叶一枝花已被列为国家重点保护野生药材濒危物种[6-7]。因此，积极开展七叶一枝花组织培养是解决当前重楼药材严重短缺和更好地保护其野生植物资源的有效方法。然而到目前为止，关于七叶一枝花植物的组织培养还未取得实质性进展[8-12]。本研究以福建七叶一枝花的小苗、根、带柄叶为外植体，开展组织培养工作，以期利用组织培养技术有效解决福建七叶一枝花种苗繁育的瓶颈问题，为生产七叶一枝花植物次生代谢产物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

七叶一枝花采自福建省三明市沙县大佑山，海拔900 m，在2—3月，取1 a生的整株植株带土挖取，置于自封袋内带回实验室。重楼皂苷含量检测采取七叶一枝花组培苗组培过程中，产生的愈伤组织、根系和块茎。

重楼皂苷Ⅰ对照品(111590-201604)、重楼皂苷Ⅱ对照品(111591-201604)、重楼皂苷Ⅵ对照品(111592-201604)、重楼皂苷Ⅶ对照品(111593-201604)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯；水为双蒸水。其他试剂均为分析纯。Waters 2695高效液相色谱仪；WND200型粉碎机；EX1252H电子天平。

1.2 方法

1.2.1 七叶一枝花外植体消毒和诱导

选取七叶一枝花的整株小苗、根、带柄叶为外植体。在超净工作台上先将各外植体经70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒6～8 min，无菌水冲洗待用；将消毒完成的外植体接种于1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1培养基。不同类型的外植体各接种60个，20个为1个重复，重复3次。每个诱导培养80 d，有长出愈伤组织、隐芽的外植体，属诱导成功，并换算诱导率。外植体诱导率=100%×产生愈伤、隐芽的外植体数/接入外植体总数。

1.2.2 七叶一枝花增殖分化与生根培养

将长出的愈伤组织、侧芽接入分化培养基1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1中培养。分化出小苗，既切下转接生根培养基1/2MS+NAA 0.3 mg·L-1中培养。未分化的继续增殖分化培养。待有足够的增殖数量后，进行统计分析。转接时1瓶接4块，称重，转接60 d后，统计增殖率、绝对生长速率和相对生长速率。以上处理5瓶为1个重复，重复3次。

以上培养条件为温度(20±2)℃，光照时间12 h·d-1，光照度1 000～1 500 lx。

1.2.3 重楼皂苷含量测定

参照2015版《中国药典》测重楼皂苷的方法[1]，对七叶一枝花组培的块茎芽、根系、生根苗，进行重楼皂苷含量的测定。色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203 nm。进样量10 μL；检测波长205 nm；柱温25 ℃；流速为0.8 mL·min-1。

表1 梯度洗脱程序

对照品溶液的制备。分别精密称取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ对照品适量，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL中含重楼皂苷1、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ分别为0.366 7、0.338 3、0.345 6、0.326 7 mg的混合溶液，摇匀，作为混合对照品溶液。

供试品溶液的制备。取组织培养过程中的根、块茎、愈伤组织适量，粉碎成末(过3号筛)，每份精密称定0.5 g，重复3次。置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25 mL，称定重量，加热回流30 min，冷却后再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

1.2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mL，置1.5 mL的进样量瓶中，加甲醇至1 mL，即得每1 mL中含重楼皂苷Ⅰ分别为0.036 67～0.183 3 mg，重楼皂苷Ⅱ分别为0.033 83～0.169 2 mg，重楼皂苷Ⅵ分别为0.034 56～0.172 8 mg，重楼皂苷Ⅶ分别为0.032 67～0.163 4 mg的系列标准溶液，按2.1节色谱条件进样，记录峰面积，以质量浓度(x，mg·mL-1)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归。

1.2.5 样品测定

按上述色谱条件进样测定，记录液相色谱图，并计算平均含量。

2 结果与分析

2.1 不同类型外植体的诱导情况

外植体在消毒接种3 d后部分出现污染。消毒成功的小苗15 d后在块茎部位出现不同程度的膨大，30 d后叶片枯萎，现出隐芽和愈伤组织。根系和带柄叶接种后，60 d后在断口处长出愈伤组织(图1)。

a—小苗消毒接入诱导培养基；b—小苗叶片枯萎，块茎膨大，现出侧芽；c—根部断口膨大长出愈伤组织；d—叶柄断口膨大长出愈伤组织。

从表2可以看出，采用乙醇加升汞的方法能有效杀死外植体的菌类。根部染菌率最低，为10%；带柄叶染菌率最高，为50%，因此，可适当增加消毒时间降低带柄叶的污染。不同外植体类型，通过诱导培养基：1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1，能成功诱导出愈伤或隐芽，但不同外植体类型诱导率差异明显。以小苗诱导率显著最高，为58.33%，根和带柄叶诱导率差异不明显。因此，福建七叶一枝花组织培养的外植体建议采用小苗。

表2 不同类型外植体对七叶一枝花组培诱导的影响

2.2 增殖与生根

由图2可知，将诱导出的愈伤组织、侧芽转接分化培养基1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1培养，能完成正常的增殖和分化过程；将分化的小苗转接于生根培养基1/2MS+NAA0.3 mg·L-1中，则小苗块茎变粗壮，并产生大量根系。

a—丛生芽增殖；b—丛生芽分化成小苗；c—愈伤组织增殖与分化成芽；d—分化苗生根。

从表3中可以看出，不同增殖途径对组培影响很大。丛生芽途径的绝对生长速率、相对生长速率、增殖率均显著低于愈伤组织途径。不同增殖途径不影响小苗的生根，因此，福建七叶一枝花组织培养建议采用愈伤组织途径。

表3 不同组培途径对增殖的影响

2.3 标准曲线结果

按2.1节色谱条件进样，得到如图3的重楼混合对照液的HPLC色谱图。记录峰面积，以质量浓度(x，mg·mL-1)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归，得到如图4的标准曲线。从图4中可以看出，皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的R2值分别为0.998 9、0.997 2、0.997、0.997 8，表明线性条件良好，可作测量样品的标准曲线来使用。

1—重楼皂苷Ⅶ；2—重楼皂苷VI；3—重楼皂苷Ⅱ；4—重楼皂苷Ⅰ。

图4 标准曲线

2.4 不同组培产物的皂苷含量分析

七叶一枝花的主效成分为甾体皂苷。从表4和图5可以得出，组培过程中，福建七叶一枝花产生的根、块茎、愈伤组织均含有重楼皂苷成分，根部的总皂苷含量达0.342%，愈伤组织达0.339%，块茎的总皂苷含量最高，达0.497%(2015版药典要求0.6%)。3个部位的4种皂苷成分中，以偏诺皂苷—皂苷Ⅶ占绝对优势，其余3种皂苷含量极低或未检出。

表4 组培中不同部位的皂苷含量

图5 福建七叶一枝花组培过程中不同部位的HPLC色谱图

3 讨论

3.1 七叶一枝花组织培养

组培快速繁殖技术是解决七叶一枝花种苗问题的重要途径。本文在对七叶一枝花组培的过程中发现，在适宜时期选择有效外植体部位非常重要。本研究中所采用的小苗、根、带柄叶为外植体，均能成功诱导出愈伤或隐芽，但不同外植体类型诱导率差异明显。以小苗诱导率显著最高，为58.33%，而且产生的愈伤组织和丛生芽数量也更多，生长质量也更好，因而也确保了后继的成功增殖。本研究也曾采用了除第一节根茎以外的其他根茎作为外植体进行愈伤组织诱导，但最终都未获得愈伤组织，这与胡天印等[11-12]的研究结果相似。因此，七叶一枝花顶芽保持有较强的潜在分裂能力，细胞经诱导培养后较易脱分化产生愈伤组织或丛生芽，而本文采用没有伤口的整株小苗，既能减少顶芽在消毒时受到伤害，又能为顶芽块茎生长提供营养，只是如何加快愈伤组织或丛生芽的诱导速率、正确引导愈伤组织或丛生芽快速增殖，是建立福建七叶一枝花组织培养体系的关键。

3.2 七叶一枝花组培生产次生代谢产物

李恒[8]在重楼属植物的书中提到，重楼愈伤组织生长缓慢，检测出不含重楼皂苷。本研究重楼皂苷作为七叶一枝花植物中的最主要的有效成分，属于植物的次生代谢产物。经多次继代培养的福建七叶一枝花丛生芽和愈伤组织，是可以在产生大量初生代谢产物的基础上，进一步产生重楼皂苷次生代谢物。因此，通过组织培养生产重楼次生代谢产物是一种可行的、具有应用潜力的生物技术途径。在七叶一枝花植物以后的组织培养研究过程中，是否可通过改变培养基中各成分的种类、比例，提高愈伤组织的增殖率和皂苷含量还有待进一步研究。

本研究以福建七叶一枝花的小苗、根、带柄叶为外植体，开展组织培养和皂苷含量测定研究，初步建立了福建七叶一枝花组织培养体系，证实了通过组织培养获得重楼皂苷次生代谢物的可行性，为繁殖福建七叶一枝花种苗提供新途径，同时也为生产七叶一枝花植物次生代谢产物奠定了工作基础。