王清鹤 曹国磊 张秀华 王景 马荣辉 罗琴

1新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经科，乌鲁木齐 830011；2新疆医科大学附属肿瘤医院体检中心，乌鲁木齐 830011

肺栓塞，也称肺血栓栓塞症，是以各种栓子阻塞肺动脉系统为发病原因的一组疾病或临床综合征的总称，属于静脉栓塞的一种类型[1]。肺癌是我国最常见的癌症，而肺腺癌作为肺癌中最常见的一种病理类型，是肺癌患者发生肺栓塞的独立危险因素[2]。多个临床研究已经证实肺栓塞的发生与肺癌患者病死率的增加密切相关[3-4]。目前针对肺腺癌合并肺栓塞的致病相关机制尚未得到充分研究。本研究运用高通量RNA测序技术结合生物信息学分析方法筛选肺腺癌合并PE相关的差异基因，探讨其发生的分子机制，为其早期诊断和治疗奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 前瞻性研究。选取新疆医科大学附属肿瘤医院2019年1～12月住院的肺腺癌合并肺栓塞患者4例为肺腺癌合并肺栓塞组，男3例，女1例；年龄范围为31～62岁，年龄(48.5±12.9)岁，中位年龄50.5岁。选取同期入院的单纯肺腺癌患者4例为肺腺癌组，男2例，女2例；年龄范围为40～75岁，年龄(58.5±15.3)岁，中位年龄59.5岁。选取同期入院的单纯肺栓塞患者4例为肺栓塞组，男3例，女1例；年龄范围为40～80岁，年龄(60.3±16.4)岁，中位年龄60.5岁。纳入标准：肺腺癌诊断由组织病理学证实，无肺栓塞病史，无重要脏器严重疾病。肺栓塞的诊断依据中华医学会《肺血栓栓塞症诊治与预防指南》2018版[1]。排除标准：患者有其他恶性肿瘤病史，有凝血功能障碍，近期使用过影响凝血的药物。肺腺癌合并肺栓塞患者为肺腺癌诊断前3个月或诊断后24个月内发生的肺栓塞。所有患者均知情同意，本研究已通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审核批准(2019BC007)。

1.2 RNA提取和测序 每例患者于入院后24 h内采集2.5 ml静脉血，保存于-80℃冰箱，待标本收集完成后，使用Trizol(美国Invitrogen公司，批号：15596026)按照说明书提取所获全血总RNA。每个样品取3μg总RNA构建转录组测序文库，文库测序由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。

1.3 获取共同差异表达基因 对测序后的数据进行过滤和归一化处理后，采用R语言中的LIMMA软件包及DESeqR软件包分析肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组、肺腺癌合并肺栓塞组对比肺栓塞组基因的差异表达。差异表达基因筛选标准如下：(1)|log FC|≥2；(2)P≤0.05，提取差异基因并进行基因名注释，绘制两对比组差异基因火山图，并使用Venny在线工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘 制 韦 恩图，将两对比组差异基因经Excel软件取交集，选择两对比组中共有的差异基因，称之为共同差异基因。

1.4 基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析 使用Metascape网站(http://metascape.org/gp/index.html)对筛选后的共同差异基因进行GO功能及KEGG通路富集分 析(分 析 参 数：Min Overlap≥3，Min Enrichment≥1.5，P＜0.05)，通过Fisher Exact Test计算P值，以P＜0.05作为筛选条件。

2 结果

2.1 肺腺癌合并肺栓塞组、肺腺癌组及肺栓塞组差异基因表达谱 获得差异基因后，剔除FPKM小于0的基因。在肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组中共鉴定出519个差异基因，包括357个上调基因和162个下调基因；在肺腺癌合并肺栓塞组对比肺栓塞组中共鉴定出828个差异基因，包括455个上调基因和373个下调基因。将两对比组差异基因取交集，共得到147个共同差异基因，其中上调基因80个，下调基因67个(图1)。按照差异倍数的对数值由大到小将共同上下调差异基因进行排列，见表1。

图1 肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组、肺栓塞组差异基因火山图及韦恩图 A：肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组差异基因火山图；B：肺腺癌合并肺栓塞组对比肺栓塞组差异基因火山图；C：肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组及肺腺癌合并肺栓塞组对比肺栓塞组差异基因韦恩图

表1 肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组、肺栓塞组的共同上下调差异基因(各前5个)

2.2 差异基因GO及KEGG富集分析 将共同差异基因输入Matescape进行富集分析，GO分析发现两对比组共同差异基因主要富集于中性粒细胞活化、轴突发育、白细胞分化、防御反应的负调控、髓系细胞凋亡过程的负调控等过程(图2)。KEGG通路分析表明，共同差异基因主要参与代谢途径、肺结核、癌症途径、血小板活化等通路(表2)。

图2 肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组、肺栓塞组的共同差异基因富集的GO条目(前20条)

表2 肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组、肺栓塞组的共同差异基因富集的KEGG通路(前10条)

3 讨论

研究表明癌症可诱导凝血系统的激活，进而刺激肿瘤生长和扩散[5]。肺腺癌合并肺栓塞既与肿瘤相关又与栓塞联系，其发病机制复杂且影响因素众多。目前研究认为肺栓塞的形成主要与凝血系统的激活、血管内皮损伤、炎症因子表达增加等机制有关，尚缺乏相关分子机制研究。本研究利用RNA测序技术对肺腺癌合并肺栓塞、单纯肺腺癌以及单纯肺栓塞患者外周血RNA进行基因表达水平检测，并进行生物信息学分析，共筛选出147个共同差异基因，包括80个上调基因，67个下调基因。通过GO富集分析发现，两对比组共同差异基因主要参与中性粒细胞活化、轴突发育、白细胞分化等生物学过程。已有多项研究报道白细胞增多等炎症反应与癌症患者患静脉栓塞风险增加有关[6-7]，中性粒细胞可能通过产生中性粒细胞胞外陷阱来促进血栓形成[8]。KEGG通路富集分析发现，共同差异基因与代谢途径、癌症途径、血小板活化等通路联系密切。而有研究认为肿瘤细胞通过激活血小板活化诱导血小板聚集，这一过程与肿瘤细胞转移相关[9-10]，与本研究结果相类似。

本研究选择P值最小的前5个上下调共同差异基因进行分析，其中PRTN3是目前研究较为深入的基因。PRTN3编码丝氨酸蛋白酶3，其诱导加工促炎细胞因子肿瘤坏死因子α、IL-8和IL-1β，这些因子已明确在包括肺癌的各种肿瘤生长、侵袭和转移中起作用[11-12]。丝氨酸蛋白酶3还可通过干扰巨噬细胞的激活[13]、破坏细胞外基质[14]以及黏附中性粒细胞胞外陷阱[15]导致血管坏死及肺组织内皮的损伤，内皮损伤是血栓形成的重要机制之一。与丝氨酸蛋白酶3紧密联系的CD177基因也是共同差异基因，CD177编码CD177糖蛋白，在中性粒细胞跨内皮细胞迁移过程中参与炎症反应[16]。而先前的研究发现CD177在胃癌中表达上调，与本研究结果相似。CD177可作为肿瘤细胞黏附和迁移的调节因子[17]，使得丝氨酸蛋白酶3及CD177作为中枢将炎症、血管组织坏死以及肿瘤的生长侵袭互相联系了起来。本研究发现PRTN3、CD177为上调的共同差异表达基因，有理由认为PRTN3及CD177可能参与肺腺癌合并肺栓塞的发病过程。

本研究中最显著的差异上调基因为S100P。Tian等[18]用基因芯片分析鉴定了52个非小细胞肺癌的差异基因，发现S100P在NSCLC的侵袭和转移过程中表达增强，与本研究结果一致。此外，S100P的过表达增加了NSCLC细胞皮下转移瘤的血管生成及促进转移[19]，提示S100P不仅能促进NSCLC发生，还可能通过血管生成促进肺栓塞的发生。

HP基因已被证明与肺癌相关[20]，其在肿瘤血管生成领域也发挥作用[21]。Zhang等[22]的研究发现HP在急性肺栓塞患者的血清和肺动脉中表达上调，提示HP可能参与了急性肺栓塞的病理生理过程，可作为急性肺栓塞的潜在生物标志物。因此，HP是探索肺腺癌合并肺栓塞患者生物学过程中一个可以考虑的方向。

本研究发现EPHA4在肺腺癌合并肺栓塞组中为显著下调差异基因，EPHA4基因编码Eph受体A4蛋白，有研究发现，EPHA4基因中/高表达的NSCLC患者生存时间明显长于阴性/弱表达的NSCLC患者(P=0.019)[23]。Saintigny等[24]在肺腺癌亚组中，EPHA4的表达与患者总生存期呈正相关，提示其可能是一种肿瘤抑制因子，该研究中还发现EPHA4减少了细胞迁移和侵袭。有研究发现，在小鼠模型中EPHA4的缺失可以增加血管平滑肌细胞的收缩性，从而导致高血压表型[25]，提示EPHA4对于血管内皮有一定调控作用，而EPHA4是否在肺腺癌合并肺栓塞过程中起作用，需要进一步的研究。

综上所述，本研究发现了肺腺癌合并肺栓塞患者的差异表达基因(CD177、S100P、HP、EPHA4、PRTN3等)和肺腺癌合并肺栓塞患者差异表达基因富集的多条通路(代谢途径、癌症途径、血小板活化等)。未来的研究将进一步验证及探索这些基因在肺腺癌合并肺栓塞患者中的表达水平、肺腺癌合并肺栓塞发病过程中的生物学功能，以及参与的通路与肺腺癌合并肺栓塞发病机制之间的关联，以改善和提高肺腺癌合并肺栓塞的诊断和治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突