李少华姜丽萍牛佳瑶王乐牛嗣云齐峰

(1.河北大学附属医院 新生儿科,河北 保定 071000；2.河北大学 基础医学院,河北 保定 071000；3.保定市第一医院 呼吸科,河北 保定 071000)

中老年男性随着睾丸组织间质细胞衰老及功能下降,生成睾酮的能力下降,临床表现为性欲减退,肌肉体积和力量减小,内脏脂肪增加,骨密度减少,情绪异常[1].传统中药在延缓衰老中发挥重要作用.现有研究表明,何首乌具有抗氧化、抗衰老以及神经保护等多种药理作用[2],其中二苯乙烯苷为其主要特征性成分[3].胰岛素/胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)信号通路在激素调节衰老中发挥重要作用[4],但二苯乙烯苷通过胰岛素/IGF-1信号通路调节睾丸衰老的研究鲜有报道.因此,本研究从睾丸组织间质细胞着手,采用自由基氧化损伤的方法建立睾丸组织间质细胞的衰老模型,通过流式细胞术、RT-qPCR等现代分子生物学技术,探讨二苯乙烯苷调节胰岛素/IGF-1信号通路延缓大鼠睾丸间质细胞衰老的作用机制.

1 材料和方法

1.1 实验动物

从河北医科大学实验动物中心购买(350±20)g的SPF级雄性Wistar大鼠(合格证号:No.1510063).根据中国科学技术部制定的“实验动物护理和使用指导意见”及河北大学动物护理和伦理委员会的指导方针进行实验动物的处理和实验的开展.

1.2 实验试剂

二苯乙烯苷标准品(中国成都植标化纯生物技术有限公司),Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司),胎牛血清FBS(fetal bovine serum,以色列Biological Industries公司),DMEM/F12(美国Gibcos公司),β-半乳糖苷酶染色试剂盒、细胞周期检测试剂盒和蛋白裂解缓冲液(中国Beyotime公司),RNA快速提取试剂盒(中国艾德莱公司),反转录试剂盒(日本TaKaRa公司),兔源一抗(美国Santa公司),羊抗兔二抗(中国Proteintech公司).

1.3 二苯乙烯苷适宜用药量的确定

浓度梯度设置为20、50、100、150、250μmol/L,作用于培养了48 h后处于对数生长期的细胞,作用时间为24、48、72 h,酶标仪检测吸光度,采用MTT 法筛选出二苯乙烯苷作用于睾丸组织间质细胞的最适浓度为150μmol/L,作用时间为48 h.

1.4 睾丸间质细胞的培养

选用17～25 d龄的雄性Wistar大鼠(n＞3),无菌操作取两侧睾丸组织,置于Ⅰ型胶原酶中消化数分钟,获取睾丸组织间质细胞,使用细胞计数仪计数,以1×106/m L的细胞密度将细胞接种到FBS体积分数为10%的DMEM/F12培养液中,置于37℃细胞培养箱1h,更换新鲜培养液,48h后,鉴定睾丸组织间质细胞,3β-羟类固醇脱氢酶特异性染色液可使阳性细胞显示灰色,经过染色鉴定睾丸组织间质细胞纯度超过97%[5].待细胞融合度达80%,按1∶2的比例对细胞继代培养,传至第3代时进行细胞爬片,培养48 h后备用.

1.5 睾丸组织间质细胞分组及氧化损伤法建立衰老模型

细胞分组:根据实验目的分为正常组、衰老组和二苯乙烯苷组.

首先,按上述方法培养睾丸组织间质细胞,第3代传至六孔板,每天同一时间加等量300μmol/L 的H2O2和100μmol/L的FeSO4刺激细胞2 h,连续刺激4 d；刺激结束后,衰老组在FBS体积分数为10%的DMEM/F12培养液培养3 d；二苯乙烯苷组则加入1.3μL 二苯乙烯苷,在含体积分数为10%FBS 的DMEM/F12培养液培养3 d；正常组总培养时间需与衰老组和二苯乙烯苷组保持一致,在FBS体积分数为10%的DMEM/F12培养液中培养7 d.进行β-半乳糖苷酶染色和细胞周期的检测以鉴定细胞衰老模型,实验重复3次.

1.6 检测睾丸组织间质细胞中胰岛素/IGF-1信号通路关键因子的表达情况

1.6.1 RT-qPCR 检测各关键因子m RNA 表达水平

提取细胞总RNA 并测定浓度,使用反转录试剂盒进行反转录,以cDNA 为扩增模板,使用相应引物(表1)进行扩增.所有待测样品均做3个平行复孔,实验重复3次.

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-qPCR

1.6.2 免疫荧光染色

吸尽六孔板中的培养液,用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗2遍,细胞固定通透后,加入体积分数为10%的封闭用正常山羊血清,室温孵育12 min.加入目的蛋白一抗稀释液(稀释比例均为1∶200),4℃过夜.用PBS洗3遍.加入二抗(稀释比例为1∶1 000)37℃避光孵育20 min.PBS洗3遍,在DAPI室温孵育15 min,PBS洗3遍,5 min/遍,加入适量甘油进行封片.每组至少选取3张爬片,荧光显微镜下随机观察15个视野,实验重复3次以上,使用Image J软件和SPSS (20.0系统)计算目的蛋白平均光密度和统计学分析.

1.6.3 免疫印迹

用蛋白裂解缓冲液裂解睾丸组织间质细胞.使用BSA 蛋白质定量检测试剂盒计算蛋白质浓度.制备相应浓度的浓缩胶和分离胶,蛋白样品上样量为50μg,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳120 V、30 min进行浓缩,80 V、1 h进行分离目的蛋白,并转移至PVDF膜,用质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉封闭,室温孵育1 h.将目的条带正面朝下放入用TBST稀释的一抗(稀释比例为1∶1 000),4℃孵育过夜,置摇床上用TBST洗涤；加入与一抗匹配的辣根过氧化物酶偶联的二抗(稀释比例为1∶10 000)37℃孵育1 h,TBST清洗后,将PVDF膜与ECL发光液(V(A液)∶V(B液)=1∶1)充分接触,使用ECL发光系统显影.每组实验均重复3次以上,采用Image J软件分析目的蛋白的灰度值,以β-actin为内参,计算目的蛋白的相对表达量.目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/β-actin 灰度值.

1.7 统计分析

2 结果

2.1 MTT 法筛选二苯乙烯苷作用浓度结果

分别选用作用24、48、72 h和20、50、100、150、250μmol/L 用药浓度进行比较,研究结果如图1所示,浓度为150μmol/L作用48 h效果较佳.

图1 不同浓度二苯乙烯苷作用于睾丸组织间质细胞的细胞活力Fig.1 Cellular activity of leydig cells of testis with different concentrations of tetrahydroxystilbene glucoside

2.2 鉴定睾丸组织间质细胞衰老模型

2.2.1 睾丸组织间质细胞衰老染色结果

细胞衰老β-半乳糖苷酶试剂盒,以X-Gal为底物,在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成蓝色产物.染色结果显示:与正常组相比,衰老组β-半乳糖苷酶阳性率明显升高,可达60%以上,具有统计学差异(P＜0.05)(图2).

图2 睾丸组织间质细胞β-半乳糖苷酶染色结果Fig.2 Results ofβ-galactosidase staining of leydig cells of testis

2.2.2 细胞周期变化情况

细胞衰老后周期会阻滞,结果显示:衰老组相较于正常组,G1 期在细胞周期的占比显著升高(P＜0.05),S期、G2期在细胞周期的占比明显降低(P＜0.05),表明睾丸组织间质细胞阻滞在G1期,表明细胞发生衰老(表2).

表2 睾丸组织间质细胞细胞周期分布结果Tab.2 Results of cell cycle distribution in leydig cells of testis

2.3 二苯乙烯苷对胰岛素/IGF-1通路关键因子转录水平的调控作用

结果显示:衰老组相较于正常组,INSR、IGF-1、IRS2、IRS1的m RNA 表达水平明显下调(P＜0.05),IGFBP3表达明显上调(P＜0.05).二苯乙烯苷干预后可逆转该现象(P＜0.05),具有统计学差异(图3).

图3 二苯乙烯苷对睾丸组织间质细胞胰岛素/IGF-1通路关键因子mRNA表达水平的调控作用Fig.3 Regulation of tetrahydroxystilbene glucoside on mRNA expression levels of key factors of the insulin/IGF-1 pathway in leydig cells of testis

2.4 二苯乙烯苷对睾丸组织间质细胞胰岛素/IGF-1通路关键因子蛋白水平的调控作用

在免疫荧光染色中,阳性产物显示红色荧光(图4),结果显示:与正常组相比,胰岛素/IGF-1通路关键因子INSR、IGF-1、IRS2、IRS1在衰老组的表达明显下调(P＜0.05),二苯乙烯苷干预后可逆转关键因子的表达(P＜0.05).免疫印迹实验结果显示:胰岛素/IGF-1通路关键因子的表达情况与荧光免疫染色结果一致(P＜0.05)(图5).

图4 睾丸组织间质细胞胰岛素/IGF-1通路关键因子免疫荧光染色结果Fig.4 Immunofluorescence staining of key factors of the insulin/IGF-1 pathway in leydig cells of testis

图5 睾丸组织间质细胞胰岛素/IGF-1通路关键因子免疫印迹检测结果Fig.5 Western blotting results of key factors of the insulin/IGF-1 pathway in leydig cells of testis

3 讨论

各种衰老相关疾病伴随着衰老发生,60岁以后,睾丸退化,性激素分泌减少,导致生育力下降和相关疾病,大量研究表明,中医药在抗衰老和治疗不孕不育方面发挥重要作用[5-6].何首乌为常见的补益类中药,在临床中具有广泛的应用,其药理活性主要有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化以及神经保护等作用,在治疗神经退行性疾病、防治动脉粥样硬化、降血糖等方面具有潜力,其药效成分主要包括二苯乙烯苷类、蒽醌类以及黄酮类,其中二苯乙烯苷显示出多种生物活性[7].

Kramer等[8]的研究结果表明,氧化应激是造成衰老的重要因素.本研究使用H2O2和FeSO4联合刺激睾丸组织间质细胞致其氧化损伤来建立衰老模型.研究表明,β-半乳糖苷酶在衰老细胞中的活性相较于在正常细胞中会明显增加,由于易于检查,这一特征已被广泛用作细胞衰老的组织化学标记[9]；细胞衰老后细胞周期会发生阻滞[10].通过β-半乳糖苷酶染色和对细胞周期变化情况的检测,发现衰老组相较于正常组,β-半乳糖苷酶阳性率和G1期在细胞周期的占比显著升高；S期、G2期的结果与G1期相反,在细胞周期的占比降低,表明睾丸组织间质细胞在G1期发生阻滞,这与文献报道一致.综上,睾丸组织间质细胞衰老模型成功建立.

IGF家族于1957年首次被发现[11].IGF-1是IGF家族重要的一员,由70个氨基酸残基组成,是与胰岛素分子结构类似的单链多肽,其相对分子质量为7 649 ku,可与IGF-1受体、胰岛素受体(insulin receptor,INSR)以及两者的杂合受体相互结合,以旁分泌和自分泌方式在组织生长发育、细胞代谢、增殖、分化、凋亡和调节衰老中发挥关键作用[11-13].研究表明,IGF-1激活IGF-1/PI3K/AKT和IGF-1/MAPK/ERK 两条途径促进细胞的增殖[14].IGF-1可以改善精子的活力、寿命和膜的完整性[11,15],可激活在衰老过程中发生改变的自噬/溶酶体系统,促进过氧化物酶体增殖,维持线粒体结构与功能稳定,降低因衰老而引起的过度氧化应激反应[16].胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3,IGFBP3)也是IGF家族的一员,可结合IGF-1抑制其生物活性[6].本研究发现,衰老的睾丸组织间质细胞中IGFBP3的表达水平相较于正常组显著升高,INSR、IGF-1表达水平相较于正常组显著降低,可见IGFBP3分泌的增加抑制了IGF-1对细胞的促增殖作用,而二苯乙烯苷可以逆转该现象,发挥抗衰老的作用.

胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)蛋白家族是胰岛素/IGF-1信号的关键介体,参与代谢激素的控制[6].IRS1、IRS2是胰岛素/IGF-1信号传导关键节点中最重要的代表[17].在哺乳动物的4种IRS蛋白中,IRS1和IRS2在调节生长和存活,代谢和衰老中起关键作用[18].本研究通过RT-qPCR、免疫荧光和免疫印迹技术检测发现衰老的睾丸组织间质细胞IRS1、IRS2表达水平明显降低,二苯乙烯苷干预后可逆转上述现象.综上,二苯乙烯苷可上调衰老的睾丸组织间质细胞IGF-1、INSR、IRS1、IRS2表达水平,明显下调IGFBP3 m RNA 水平.充分表明二苯乙烯苷延缓睾丸组织间质细胞的衰老可通过调控胰岛素/IGF-1信号通路关键因子的表达来实现,胰岛素/IGF-1信号传导通路是二苯乙烯苷延缓大鼠睾丸组织间质细胞衰老的重要途径之一.