孙枭琼崔铁峰方楠王印开王宏伟

(1.河北大学 生命科学学院,生命科学与绿色发展研究院,河北 保定 071002；2.河北省唐山市曹妃甸区农业农村局,河北 唐山 063000)

浮游动物在能量传递与物质循环中起重要作用.枝角类和桡足类属节肢动物门、甲壳纲,是其他无脊椎动物和鱼类的饵料,可作为水环境变化的指示生物[1].同时,浮游动物在控制藻类生长,预防水华发生方面具有一定的作用.国内外对浮游动物的研究多集中于群落结构时空变化的生态调查,并以此反映水环境状况[2-4],同时将其应用到指示湖泊、河流水质状况和健康状况评价[5-6].

由于浮游动物个体较小,且在采集时容易造成其肢体破损,对鉴定技术具有较高的要求.因此,在本研究中将传统的形态学鉴定手段与分子生物学鉴定手段结合在一起,从而提高浮游动物鉴定的准确性.自DNA条形码概念被提出及应用后,国内外学者多将其应用于生物学物种鉴定、食品安全检测、医学等各个领域,其在浮游动物鉴定中发挥重要作用.林元烧等[7]采集胶州湾青岛海域中华哲水蚤(Sinocalanussinensis),成功提取并分析其线粒体COI基因.申欣等[8]应用生物信息学辅助以分子标记技术比较了南极磷虾(Euphausiasuperba)与泛浮游动物和后生浮游动物的线粒体基因组.Bucklin等[9]在北大西洋环流中心的美国东部马尾藻海进行研究中,应用DNA 条形码技术共鉴定出4门175种浮游动物,并分析了其生物多样性,由此可见,DNA 条形码技术作为新型的生物鉴定手段得到广泛应用.

白洋淀作为华北地区最大的淡水湖泊,在洪水储存、气候调节、生态环境改善等方面发挥重要的作用[10-11].近年来,学者对白洋淀流域研究多集中于水环境、沉积物和生物群落结构时空变化[12-15].由于白洋淀淀区在历史上多次出现干淀现象且现与其直接沟通的入淀河流仅为府河,使得其成为府河所携带物质的“汇”,加以淀区居民日常生产活动等对其产生较大影响[16].对白洋淀长期的生态环境监测和水生生物资源研究为水利工程的实施和雄安新区的建设提供参考.

1 材料与方法

1.1 样本的采集与处理

枝角类和桡足类于2018年8月采于白洋淀流域,根据上下游河流及进出水情况,共设30个样点:白洋淀1、白洋淀2、前塘淀、后塘淀、聚龙淀、孟家淀、胡家洼、泛鱼淀、鲥鯸淀、平阳淀、池鱼淀、捞王淀、大麦淀、唐家淀、龙王淀、光淀、王家寨、烧车淀(2个)、大鸭圈、八大淀、麦淀、藻苲淀(4个)、羊角淀、马棚淀、三角淀、湾篓淀.具体采样点位置如图1所示.用浮游动物网[17]在淀区采集浮游动物并置于样品瓶中,加入体积分数75%的乙醇保存.室内镜检、拍照、计数.

图1 白洋淀采样点站位Fig.1 Sample sites in Baiyangdian Lake

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序分析

采用裂解法和试剂盒法进行DNA 提取.对所提取DNA 质量浓度及纯度检测,质量浓度控制在100～300μg/m L,OD260/OD280值控制在1.8～2.1[18].对其进行COI目的基因扩增,使用琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的条带.将所扩增出的目的条带样品送至测序公司测序[19].

使用Bio Edit软件查看测序所得浮游动物线粒体COI基因序列质量并对其进行编辑,将杂峰序列及序列两头不稳定碱基序列进行剪切.编辑后的浮游动物线粒体COI基因使用MEGAX6.4软件对齐序列,基于Kimura 2-parameter模型对所拼接成功的COI基因序列构建NJ系统发育树,并对各分支进行1 000次的重复检验构建系统发育树[20]及分析遗传距离[21].

2 结果

2.1鉴定结果

2018年8月于白洋淀30个站点通过形态学鉴定方法结合DNA 条形码技术共鉴定出枝角类3科5属8种,桡足类4科9属14种.枝角类和桡足类名录如表1.

表1 白洋淀枝角类和桡足类名录Tab.1 List of Cladocera and Copepoda samples in Baiyangdian Lake

2.2 枝角类和桡足类系统发育树

测序后共拼接出21条序列,枝角类共拼接出14条序列,桡足类共拼接出7条序列.根据它们的COI序列建立的邻接(NJ)系统发育树如图2所示.

系统发育树首先分为2大分支,分别为枝角目和桡足纲.在枝角类中裸腹溞单独聚为1支,而僧帽溞和棘爪低额溞聚为1支.在桡足类中,首先被分出来的是镖水蚤属,而剑水蚤形成1个大的分支,在剑水蚤所汇成的分支中,共分为2个小的分支,分别为广布中剑水蚤和跨立小剑水蚤.所得的聚类结果与形态鉴别结果基本一致.但在发育树中呈现的大型溞单独聚为1支,与预想结果具有差异.

图2 枝角类和桡足类NJ系统发育树Fig.2 NJ phylogenetic tree of Cladocera and Copepoda

2.3 物种分布与环境相关性分析

2.3.1 典型相关性分析排序

根据各样点枝角类和桡足类分布情况与水环境因子进行典型相关性分析(CCA).结果如表2所示.

表2 枝角类和桡足类分布与环境因子的CCATab.2 CCA of environmental factors and distribution of Cladocera and Copepoda

依据CCA 结果(表2),4个排序轴对分布变异性(本征值)的解释度逐渐减小,其中主成分轴(3、4排序轴)所能解释的数据比重达42.64%；另外物种分布与环境因子之间的相关系数非常高,介于0.88～0.97,共解释两者总方差的62.55%,表明此结果能较好地反映枝角类和桡足类分布与环境因子之间的关系.

2.3.2 环境因素与CCA 排序

根据枝角类和桡足类分布进行了环境因子显著性检验和CCA.结果如表3和图3所示.

表3 环境因子解释的显著性检验结果Tab.3 Interpretation results for significance test of environmental factors

图3 枝角类和桡足类与环境因子的CCA排序Fig.3 CCA sequencing diagram of environmental factors with Cladocera and Copepoda

由排序分析可知,环境因子Zn含量对于枝角类和桡足类的分布有显著影响.枝角类的分布与Zn、S、NH+4、Pb和Cu含量呈正相关,其中桡足类近邻剑水蚤、等刺温剑水蚤、跨立小剑水蚤、草绿刺剑水蚤的分布和S、Cu、Zn含量呈正相关；而模式有爪猛水蚤、台湾温剑水蚤和透明温剑水蚤的分布与P、石油烃、Chla、Cd和Pb含量呈正相关；虫宿温剑水蚤的分布与Mn O-4、NO-3、As含量及温度(T)呈正相关.对于2018年7～8月的水环境因子进行主成分分析,见图3.共分为4个主成分,累计方差贡献率62.55%.第1主成分与酸碱度(p H)、浊度、DO 和NO-3含量有关,方差贡献率为18.29%,第2主成分与Cu、S、Zn和NH+4含量有关,方差贡献率为16.84%,第3主成分与Chla、Pb和石油烃含量有关,方差贡献率为15.06%,第4主成分与温度(T)、Mn O-4和As含量有关,方差贡献率为12.36%.

3 讨论与分析

枝角类系统发育树显示,裸腹溞、棘爪低额溞和僧帽溞在1个主分支上,大型溞单独在另1个主分支上.这和预期的结果存在差异,由于裸腹溞、低额溞、僧帽溞和大型溞都隶属于溞科,预期结果是4种溞都在同一分支.出现这种结果的原因可能是由于建立系统发育树的序列经过剪切比对后基因之间差异减小[22].由此判断,根据单一基因所获得的序列获得的DNA 条形码和由此建立的系统发育树还需进一步精准确认,因此应该使用2个或多个基因共同完成系统发育树的构建,以达到更好的鉴定效果[23].桡足类系统发育树显示,依靠DNA 条形码技术对枝角类和桡足类进行鉴定可以取得较好的效果[24-25].

除捕食、竞争等生物因子外,各水环境因子对浮游动物的群落组成及演替具有重要作用.如温度对浮游动物影响相对较大,夏季水温相对其他季节较高,20℃以上溞属的数量一般很低[26].而较高的温度在限制枝角类数量的同时又通过影响水中的食物资源以及生存环境促进桡足类幼体的生长发育[27].p H 均表现为弱碱性,且各采样位点变化不大,对枝角类和桡足类分布影响较小.

部分水环境因子是湖泊本身所具有的,而大部分水环境因子变化与人们的活动息息相关.白洋淀流域环境的变化,不单单是由于水利工程活动的影响,在白洋淀流域附近居住的村民的人为影响也应该考量进去.白洋淀淀区存在人口密度大、开发强度高的现象,也导致了白洋淀流域环境的复杂性.在居民活动中家禽畜养殖、餐饮业、旅游业占较大比例,生活废水等未经处理直接入淀现象大为存在,导致淀中营养盐含量较高[28].营养盐对浮游动物具有重要的影响,通过影响浮游植物数量以及Chla含量的变化从而间接影响浮游动物的密度与生物量[29],同时浮游动物的丰度和密度会随水体富营养化的加重而增加,桡足类浮游动物的丰度和密度增加明显,枝角类浮游动物的丰度和密度会随水体富营养化的加重而减少[30].本研究中,从图3中可以看出枝角类与环境中P含量呈负相关.这也与李娟[31]等在太湖所研究的浮游动物与水环境因子相关性所得结论相一致.大部分样点中占据优势的种类为桡足类中的透明温剑水蚤及等刺温剑水蚤,这也与当地P、NH+4含量较高的实际情况相符.但采样位点藻苲淀3、藻苲淀4的P含量相对于其他位点较高,但其优势物种透明温剑水蚤相对较少,这与浮游动物根据温度及光照强度在水体中进行垂直运动的生活习性有关[32].综上两点,证实了枝角类存在数量及种类相对于桡足类较少的浮游动物分布状况.

根据检验得到的环境因子的显著性检验结果见表3.Zn对枝角类和桡足类分布的解释度为9.1%,并对枝角类和桡足类的分布具有显著影响(P＜0.05),说明它是枝角类和桡足类区域性分布差异的主要原因.同时S和Pb也对枝角类和桡足类空间分布有一定影响,但未达到显著水平.Zn、Pb、S含量相对较高的样点主要集中于白洋淀1、白洋淀2、烧车淀1、烧车淀2、唐家淀、藻苲淀2样点,水体中的重金属离子及酸性物质主要来自淀区的生活废水、餐饮业废水、农药残留及旅游业垃圾排放[33].低浓度的重金属对浮游动物所产生的效果不明显,但高浓度的Zn和Pb等重金属通过抑制浮游动物的摄食、生长活动以及休眠卵的发育来影响其生存率并不同程度地富集于生物体内,通过食物链的形式传递给更高级的消费者[34].但不同的浮游生物对重金属的耐受程度不同,从而所作出的反应也不同[35].

由此得出,每个物种的生长都受不同水环境因子影响,相同水环境因子对不同物种的分布影响存在差异[36].综上,可根据在不同位点枝角类和桡足类物种群落组成及演替来判断该区域水环境因子变化,以此来监测水质变化情况[37],为白洋淀流域水环境监测与评价提供数据支持.

致谢:感谢河北省海洋与水产科学研究院海洋渔业生态环境监测站肖国华研究员提供环境数据.