史新琛 ， 徐海明 ，2， 郝艳星 ， 张映驰 ， 张鹏举 ，2， 田大年 ，2

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004； 2.宁夏回族自治区环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004）

一直以来，长期接触煤尘导致的煤工尘肺是我国最主要的法定职业病之一[1]。关于尘肺的发病机制学说众多，目前趋向于综合作用学说[2]。早期的研究[3-5]表明，煤工尘肺患者及煤工尘肺实验动物模型生物样本中（如外周血血清、肺泡灌洗液等）存在氧化应激失衡及炎性反应等现象。在参与炎症反应的诸多信号通路中，胆碱能抗炎通路是一条与神经免疫机制相关的抗炎通路，通过分泌乙酰胆碱（ACh），抑制炎性因子释放，快速而直接地调节全身性炎性反应。一方面，ACh 是中枢神经系统中关键的神经递质。另一方面，很多非神经细胞也可以合成ACh 并以自分泌和旁分泌的方式释放至细胞外液，作用于ACh 受体，参与调节细胞增殖、分化等生理学过程，该系统称为非神经元型胆碱能系统[6]。

课题组前期研究[7]表明，非神经元型胆碱能系统关键分子乙酰胆碱酯酶（AChE）在煤工尘肺患者外周血血清中降低。研究[8-10]表明，非神经元型胆碱能系统与上皮-间质转化（EMT）密切相关。本研究拟采用人肺腺癌A549 细胞为靶细胞，同时探讨煤炭标准物质对胞内氧化应激平衡、炎性细胞因子及非神经元型胆碱能系统关键分子AChE 活性和ACh 受体的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞

人肺腺癌A549 细胞为来源于2 型肺泡上皮细胞的细胞株，用含10%小牛血清和1%青链霉素的DMEM 培养液于37 ℃、5%二氧化碳条件下培养，用0.125%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化传代，2～3 d 传代 1 次。

1.2 煤尘

煤尘标准物质GBW11104 购自国家标准物质中心，粒径＜5 μm（图 1），硫含量 1.29%，灰分27.35%，挥发分7.94%，碳64.59%，不含二氧化硅。将坩埚用双蒸水清洗干净，置于含30%硝酸的液体中浸泡24 h，取出坩埚，用蒸馏水冲洗坩埚，待其自然晾干。将煤尘置于坩埚中，放于马弗炉中，300 ℃烘烤4 h，待恢复至常温，取出坩埚，将煤尘放于15 mL 洁净的离心管中。随后，将煤尘加入完全培养基中，配制成1 mg·L-1浓度的煤尘毒物，现用现配，使用前梯度稀释成相应浓度。

图1 煤尘标准物质GBW11104 电镜表征图（×10000）

1.3 细胞染毒

将细胞悬液密度调整为8.0×104个/mL，接种于 96 孔板中（100 μL/孔）。设置空白组、对照组及 50、100、200、400、600 μg·mL-1暴露组。围绕实验孔的外围孔中加1×PBS 溶液，用于维持湿润条件。空白组只加入100 μL 的完全培养基，不接种细胞。待细胞生长24 h 后，吸走培养基，空白组和对照组每孔加100 μL 的完全培养基，各个暴露组加入相应浓度的煤炭标准物质工作液，染毒时长为24 h。暴露结束后，在空白孔、对照孔及暴露孔内均加 10 μL 的 CCK8 溶液，37 ℃孵育1 h，用酶标仪测定各孔的光密度值，测定波长为450 nm。校正吸光度值（OD）为扣除空白孔OD 值之后的数值。

1.4 细胞上清液及裂解液收集

将细胞悬液密度调整为2×105个/mL，接种于 6 孔板中（2 mL/孔）。根据 CCK-8 实验结果，选择对细胞活力无影响的剂量为暴露浓度，暴露时长为24 h。暴露结束后，将上清液收集至离心管，用于测定白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达水平。随后，加入预冷PBS 轻洗2 次，使用细胞刮刀刮取细胞并转移至离心管中，加入100 μL浓度为 0.4 mmol·L-1的低盐裂解液（含 0.5 mol·L-1的苄脒盐酸盐），剧烈振荡30 s，冰上静置4 min，重复上述操作 5 次。4 ℃低温离心（12000 r·min-1）后，收集上清液用于测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及AChE 表达水平。

1.5 生化测定

使用考马斯亮蓝染色法测定样品中的总蛋白；通过比色法测定SOD（南京建成生物工程研究所）及MDA（北京华英生物技术研究所）水平；采用ELISA 法测定IL-6 水平（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；通过改良Ellman 法测定AChE 的活性。根据各试剂盒的线性测定范围确定合适的稀释倍数。

1.6 基因表达水平的测定

使用一步法提取总RNA，逆转录合成cDNA第一条链，荧光定量PCR 法检测CHRNA9（Gen－Bank No. NM_017581.4）mRNA 逆转录合成第一条cDNA 链的拷贝数，CHRNA9 上游引物序列为5’-CAGAGACGGCAGATGGAAA-3’，下游引物序列为 5’-CCACTGGACGAAGAGCATTAGAA-3’，管家基因 β-actin（GenBank No. NM_001101.5）上游引物序列为5’-GACTACCTCATGAAGATCCTCACC-3’，下游引物序列为 5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3’，使用 2-△△CT法分析数据。

1.7 统计学方法

数据运用SPSS 22.0 软件进行统计分析。正态分布的资料采用均数±标准差（）描述，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD 法。非正态分布数据使用中位数（四分位数间距）［M（Q）］描述，两组组间比较采用 Mann-Whitney U 检验的方法，多组组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验的方法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 煤炭标准物质GBW11104 暴露对人肺腺癌A549 细胞活性的影响

煤炭标准物质GBW11104 刺激A549 细胞24 h 后，测定细胞的存活率。结果表明，50、100、200 μg·mL-1煤炭标准物质刺激细胞 24 h 后，对细胞存活率均无影响（P 均＞0.05），见表1。在后续的暴露实验中选择这3 个剂量进一步研究煤炭标准物质暴露对A549 细胞的损伤效应。

表1 煤炭标准物质GBW11104 刺激人肺腺癌A549细胞 24 h 后对细胞活性的影响（）

表1 煤炭标准物质GBW11104 刺激人肺腺癌A549细胞 24 h 后对细胞活性的影响（）

注：有相同字母视为组间差异无统计学意义，无相同字母视为组间差异有统计学意义。

煤炭标准物质浓度/（μg·mL-1）n24 h 0 9 1.23±0.12a 50 9 1.03±0.19a 100 9 0.99±0.20a 200 9 0.90±0.16a 400 9 0.81±0.02bc 600 9 0.72±0.14c

2.2 煤炭标准物质GBW11104 刺激下对A549细胞中SOD、MDA 及IL-6 表达水平的影响

GBW11104 暴露可以导致细胞内SOD 活性发生不同程度的变化。与对照组相比，100 μg·mL-1暴露组 SOD 活性降低了 15.4%（P＜0.05）。 暴露后各剂量组MDA 水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）。与对照组相比，100、200 μg·mL-1暴露剂量下IL-6 水平分别升高了74.5%和77.9%（P均＜0.05），见表 2。

表2 煤炭标准物质GBW11104 刺激人肺腺癌A549 细胞24 h 后对 SOD、MDA 及 IL-6 水平的影响（）

表2 煤炭标准物质GBW11104 刺激人肺腺癌A549 细胞24 h 后对 SOD、MDA 及 IL-6 水平的影响（）

注：有相同字母视为组间差异无统计学意义，无相同字母视为组间差异有统计学意义。

IL-6/（pg·μL-1）0 3 10.31±0.86a 44.97±2.06a 6.05±1.46b 50 3 9.49±1.21ab 45.57±2.71a 6.85±1.57b 100 3 8.72±0.94b 47.77±7.10a 10.56±3.55a 200 3 9.40±1.65ab 49.23±4.10a 10.76±1.66a煤炭标准物质/（μg·mL-1） nSOD/（U·mg prot-1）MDA/（pmol·mgprot-1）

2.3 煤炭标准物质GBW11104 刺激人肺腺癌A549细胞24 h 后对AChE 活性的影响

GBW11104 暴露可以导致细胞内AChE 活性发生不同程度的变化。与对照组相比，100 μg·mL-1暴露组 AChE 活性降低了 12.2%（P＜0.05），见图2。

图2 煤炭标准物质GBW11104 刺激人肺腺癌A549 细胞 24 h 后对 AChE 活性的影响（）

2.4 煤炭标准物质GBW11104 刺激对A549 细胞中的AChE 受体CHRNA9 mRNA 的表达水平

GBW11104 暴露与A549 细胞中非神经元型胆碱能系统关键分子ACh 受体CHRNA9 mRNA表达水平的剂量-反应关系呈倒U 形曲线。50、100、200 μg·mL-1暴露剂量下细胞内CHRNA9 mRNA 表达水平分别相当于对照组的231%、167%和 71%（P 均＜0.05），见图 3。

图3 煤炭标准物质GBW11104 刺激人肺腺癌A549 细胞 24 h 后对 CHRNA9 mRNA 表达水平的影响（）

3 讨论

在尘肺发生、发展过程中，机体氧化和抗氧化平衡被打破是关键事件之一。SOD 是机体重要的清除自由基的物质，机体开始接触粉尘时会产生大量的自由基，SOD 表达水平应激增高用以清除自由基。随着接触时间的延长，SOD 被逐渐消耗，其含量也降低。MDA 是生物膜的多不饱和脂肪酸过氧化分解的终产物，它通过交联核酸等大分子物质使组织老化，其含量可以作为机体生物膜受损伤程度的定量指标之一[3，11-12]。在本研究中，尽管煤炭标准物质瞬时刺激并未影响A549 细胞中MDA 表达水平，但却导致SOD 水平下降。提示煤炭标准物质暴露从一定程度上影响了A549细胞内的氧化和抗氧化平衡。

IL-6 是由巨噬细胞和成纤维细胞等多种细胞分泌的一种细胞因子，在尘肺的发生、发展中发挥抗炎、促炎、致纤维化等多种作用[12-13]。课题组前期研究[7]表明，与对照人群相比，煤工尘肺人群血清中IL-6 水平升高。Meta 分析结果[14]表明，IL-6 基因-174C/G 位点多态性与尘肺易感性之间无相关性，-634C/G 位点多态性与尘肺易感性之间有相关性，-634C/G 位点CC 基因型是尘肺的易感基因型。本研究中，GBW11104 刺激A549细胞24 h 后，上清液中IL-6 的表达量逐渐升高。这一结果提示，外源性煤炭标准物质可以诱导A549 的炎性反应。

ACh 除了作为一种神经递质在神经细胞中传递信息外，也可被非神经细胞合成并以自分泌和旁分泌的方式释放至细胞外液，作用于ACh受体，参与调节细胞增殖、分化等基本的生物学活动，此被称为非神经元型胆碱能系统[15]。值得注意的是，肺泡上皮细胞也可合成和分泌ACh，同时表达ACh 受体。研究[8]表明，外源性的ACh受体激动剂（如卡巴胆碱）作用于ACh 受体能促进A549 细胞的上皮-间质转化过程（EMT）。本研究中，煤炭标准物质暴露引起A549 细胞中AChE活性下降，同时可以影响CHRNA9 mRNA 的表达水平。上述结果提示，煤炭标准物质暴露可能通过影响非神经元型胆碱能系统关键分子AChE及ACh 受体的水平，进而影响A549 细胞的EMT过程。因此，下一步应该重点关注煤炭标准物质对A549 细胞EMT 结局的影响。

综上，煤炭标准物质GBW11104 暴露对人肺腺癌A549 细胞有一定的毒性作用，具体表现为影响中氧化和抗氧化平衡、导致炎性反应、影响非神经元型胆碱能系统关键分子AChE 及ACh受体的水平。