柳科军 ， 牛一鸣 ， 郝 继 ， 卜 阳 ，2

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏回族自治区人民医院肝胆外科，银川 750002）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）（以下简称肝癌）在全球范围内的发病率一直呈上升趋势，且肝癌切除术后5 年肿瘤复发转移率高达40%～70%，而对其转移复发仍缺乏有效治疗措施[1-2]，探索新的肝癌治疗靶点对提高肝癌术后生存率和改善患者生存预后具有重要意义。CCN2（connective tissue growth factor，CTGF/CCN2）作为一种分泌型蛋白，能够与肿瘤微环境中细胞外基质相互作用，促进肿瘤组织血管的生成和增强肿瘤细胞的侵袭转移能力[3-4]。在肝癌中，Budhu等[5]采用表达谱芯片筛查发现，发生转移的原发性肝癌癌旁肝脏组织中CCN2 表达较无转移的肝组织明显升高。目前，尚未见CCN2 在肝癌癌旁组织中的表达及其与患者预后相关性方面的报道。本研究采用免疫组织化学法检测肝癌癌旁组织CCN2 表达水平，分析肝癌癌旁组织CCN2的表达与临床病理特征，评价CCN2 是否可以作为预测肝癌患者预后的指标，为探索抗CCN2 治疗提高肝癌疗效提供可能的理论支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究收集2010 年1 月至2017 年9 月宁夏医科大学总医院行手术切除并经病理诊断为肝细胞癌患者的临床资料和癌旁组织石蜡块（癌旁组织取自肿瘤远端切缘处），患者术前未行新辅助放化疗、经导管动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）治疗等，且患者术后随访资料完整。最终纳入研究的患者共155例，包括男性 124 例和女性31 例，年龄 31～82岁，平均年龄55 岁。其中，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性 137 例，肝硬化 132 例，甲胎蛋白（Alpha-fetal protein，AFP）阳性（＞20 ng·mL-1）90 例，肿瘤直径＞5 cm 者 71 例；根据美国癌症联合委员会（AJCC）第8 版TNM 分期，I～II 期 82 例，III～IV 期 73 例。所有患者均接受了3 年以上的随访，随访期间72 例患者早期肝内复发，85 例死亡。本研究通过宁夏医科大学总医院伦理委员会的批准（编号：2019-080），所有患者均知情同意。

1.2 实验试剂

Anti-CTGF 抗体（购自 Abcam 公司）；封闭用山羊血清、内源性过氧化物酶阻断剂、超敏酶标山羊抗兔IgG 聚合物及DAB 显色试剂盒（购自中杉金桥生物技术有限公司）；PBS 缓冲液（中杉金桥生物技术有限公司提供的ZLI-9063 PBS 缓冲液粉末，配制取该粉剂一包溶于2000 mL 蒸馏水（pH 为 7.2）；抗原修复液：0.01M 枸橼酸缓冲液（pH 为 6.0）；梯度浓度酒精（100%、95%、90%、80%、70%）；二甲苯；中性树胶；苏木素染剂。

1.3 实验方法

采用免疫组织化学法检测肝癌癌旁组织中CCN2 表达水平。将组织石蜡块切成厚4 μm 的石蜡切片，水浴锅展片后贴附在载玻片上，置于烤箱中60 ℃烤片2 h。常规脱蜡水化。抗原修复后滴加内源性过氧化物酶阻断剂到组织切片上，置于37 ℃恒温箱孵育20 min。PBS 冲洗后山羊血清封闭，置于37 ℃恒温箱孵育25 min。滴加一抗后置于湿盒内4 ℃过夜。室温复温1 h 后用PBS 冲洗3 次，每次5 min。滴加二抗后37 ℃恒温箱孵育 30 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗后1%盐酸酒精分化10 s，流水冲洗10 min；氨水返蓝15 s，双蒸水冲洗1 min。组织切片依次浸入梯度酒精脱水；接着浸入在二甲苯脱水、透明切片和中性树胶封片后，显微镜观察拍照。

1.4 结果判定

CCN2 阳性判断标准：CCN2 阳性结果为细胞质内出现黄色或棕黄色颗粒。用已知的肝癌癌旁组织CCN2 阳性表达作为阳性对照，以PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照。以细胞质着棕黄色为阳性判断标准；根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度。在高倍镜下对细胞内反应如下评分：（1）着色强度：无着色为0 分，淡黄色为1 分，黄色为 2 分，棕黄色为 3 分；（2）阳性细胞数计分：＜5%为 0 分，5%～25%为 1 分，26%～50%为 2分，51%～70%为3 分，＞70%为4 分。染色判定总分为阳性细胞数计分与着色强度计分的乘积，若染色判定总分≤6 分为低表达水平，＞6 分为高表达水平[6]。

1.5 随访方法

对纳入标准的患者术后定期随访，采用门诊复查和电话等方式进行随访。手术后第1～2 年每3 个月随访 1 次，第 3～5 年每 6 个月随访 1 次。随访终止日期至2020 年9 月30 日。生存时间从手术时间开始算起，至末次随访时间或死亡时间。根据影像学的结果，将肝脏上新发病灶或在身体其他部位中发现的新转移病灶视为肝癌患者复发的标准，将早期肝内复发定义为肝切除术后1年内肝脏发现新的癌灶。

1.6 统计学方法

数据运用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计数资料以频数或率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman 秩相关分析肝癌癌旁组织CCN2 表达水平和肝癌患者临床特征的相关性。无病生存期（disease-free survival，DFS）为自手术之日至首次复发或死亡之日。总生存期（overall survival，OS）为从手术之日到死亡之日，或最后一次随访之日。采用Kaplan－Meier 法比较不同癌旁组织CCN2 表达水平患者的生存率，组间差异比较采用秩和检验，应用Cox 比例风险模型分析肝癌患者预后的影响因素。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌癌旁组织中CCN2 的表达情况

如图1 所示，CCN2 在肝癌癌旁组织石蜡切片中阳性染色主要定位于细胞质，呈现棕黄色颗粒。在本研究155 例肝癌术后病理切片中，CCN2呈高表达水平为93 例（60.00%），CCN2 呈低表达水平为 62 例（40.00%）。

图1 CCN2 在肝癌癌旁组织中的表达（SP 法）

2.2 CCN2 表达水平与肝癌患者一般临床资料的关系

如表1 所示，肝癌癌旁组织CCN2 表达水平在年龄、吸烟史、饮酒史、AFP 水平、HBsAg、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆红素（total bilirubin，TB）水平及凝血酶原时间（prothrombin time，PT）上差异均无统计学意义（P均＞0.05），癌旁组织CCN2 表达水平在性别、白蛋白（albumin，ALB）水平及肝内早期是否复发中的差异均有统计学意义（P 均＜0.05）。

2.3 CCN2 表达水平与肝癌临床病理特征的关系

如表2 所示，肝癌癌旁组织CCN2 表达水平在合并肝硬化、肿瘤分化程度和发生淋巴结转移上差异均无统计学意义（P 均＞0.05），癌旁组织CCN2 表达水平在侵犯肝包膜、肿瘤直径、T 分期及远处转移中差异均有统计学意义（P 均＜0.05）。

2.4 CCN2 与肝癌患者临床病理特征的相关性分析

Spearman 秩相关分析结果显示：肝癌癌旁组织CCN2 表达水平与性别、侵犯肝包膜、肿瘤直径、T 分期、远处转移及肝内早期复发均呈正相关关系，与白蛋白水平呈负相关关系（P 均＜0.05），见表3。

2.5 CCN2 表达水平对肝癌患者的预后评估

采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，155 例患者 OS 为 1～112 个月，中位 OS 为 42 个月。癌旁组织CCN2 低表达组和CCN2 高表达组患者的平均 OS 分别为 84.27（95%CI:73.05～95.50）个月和 37.56（95%CI:32.32～42.80）个月，差异有统计学意义（P＜0.001）（图 2A）。癌旁组织 CCN2 低表达组和CCN2 高表达组患者的平均DFS 分别为48.56（95%CI:40.57～56.55）个月和 19.71（95%CI:16.18～23.24）个月，差异有统计学意义（P＜0.001）（图2B）。癌旁组织CCN2 低表达组的1 年和3年OS 均高于CCN2 高表达组（98.38%vs.82.79%，80.65%vs.50.53%）（P 均＜0.001），见图 2A。 癌旁组织CCN2 低表达组的1 年和3 年DFS 均高于CCN2 高表达组（70.97% vs.45.16%，41.94%vs.18.28%）（P 均＜0.001），见图 2B。

表1 CCN2 表达水平与肝癌患者一般临床资料的关系［例（%）］

表2 CCN2 表达水平与肝癌临床病理特征的关系［例（%）］

表3 CCN2 与肝癌患者临床病理特征的相关性分析

2.6 肝癌患者预后影响因素的Cox 回归分析

单因素分析显示，侵犯肝包膜、肿瘤直径、T分期、发生远处转移和癌旁组织CCN2 高表达是影响肝癌患者预后的不良因素（P 均＜0.05）。多因素分析显示，癌旁组织CCN2 表达水平和肿瘤远处转移是肝癌患者预后的影响因素，见表4。

3 讨论

肝细胞癌占全球原发性肝恶性肿瘤的80%以上，全世界每年约有84 万新发肝癌病例，在全部恶性肿瘤中其病死率位于第3 位[1]。尽管手术切除是肝癌最主要的治疗手段，但肝癌的复发与转移仍是影响肝癌预后不良的决定性因素，因此，探究肝癌的发生和转移机制非常重要。CCN2是一种富含半胱氨酸的基质细胞蛋白，具有刺激细胞迁移、介导血管生成、调节细胞增殖等生物学功能，CCN2 的表达异常与肿瘤的发生发展、侵袭转移、复发预后密切相关[7-9]。目前，已有实验证实CCN2 是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的下游信号因子，TGF-β 能够在转录水平上激活CCN2，诱导CCN2 分泌到细胞外基质，增强CCN2 在细胞中的表达，参与肝脏纤维化及肝癌发生、发展过程[10-12]。

图2 根据CCN2 表达水平在肝癌患者中的OS 和DFS 的Kaplan-Meier 生存曲线

表4 肝癌患者预后影响因素的Cox 回归分析

Xiu 等[13]采用 CCN2（100 ng·mL-1）作用于HepG2 肝癌细胞，细胞进入S 期的比例增加，具有明显的迁移和侵袭效应。Jia 等[14]使用RNA 干扰技术下调HepG2 肝癌细胞株中的CCN2 表达，肝癌细胞生长抑制率为43%；同时抑制了HepG2细胞在软琼脂中的集落形成，CCN2 低表达水平的HepG2 细胞在裸鼠体内所形成的种植瘤体积仅占对照组HepG2 细胞肿瘤体积的35%。在肿瘤的恶性进展过程中，CCN2 似乎是肿瘤侵袭和转移的重要因素。李秀伟等[15]研究发现卵巢癌组织中CCN2 高表达与卵巢癌患者的腹膜转移情况及淋巴结转移相关，CCN2 能够促进卵巢癌组织微血管和淋巴管的生成，促进卵巢癌患者发生腹膜转移和淋巴结转移。在乳腺癌中，CCN2 高表达与肿瘤侵袭、血管生成及骨转移密切相关，以CCN2 为靶点的分子治疗能够提高乳腺癌的临床疗效[16]。陈萍萍等[17]在对186 例食管癌病例回顾性分析中发现CCN2 表达与吸烟、淋巴结转移、家族史、肿瘤大小和肿瘤病理分级密切相关，CCN2 能够促进食管癌的发生发展。在肺腺癌中，CCN2 表达与肿瘤分期、淋巴结转移、TNM 分期及胸膜侵犯明显相关，CCN2 能够影响肺腺癌细胞的迁移、凋亡等过程[18]。本研究发现癌旁组织中CCN2 表达主要定位于细胞质，在TNM 分期晚的患者中CCN2 表达增高；有包膜侵犯和早期肝内复发的患者中CCN2 表达水平升高。CCN2 表达水平与侵犯肝包膜、肿瘤直径、T 分期、远处转移及肝内早期复发均呈正相关关系，提示癌旁组中CCN2 高表达促进肿瘤细胞的增殖及肝内早期复发，参与了肝癌的侵袭和转移过程。

既往研究中，CCN2 的表达异常与其他恶性肿瘤预后之间相关性也得到了相应的理论支持。在结直肠癌患者中，CCN2 高表达提示患者生存不良，且于BRAF 基因突变及肿瘤细胞侵袭能力密切相关[19]。在胃癌患者中，CCN2 在肠型和弥漫型胃癌中高表达，并与较短的OS 有关，CCN2表达水平与不良预后呈正相关，CCN2 高表达是患者预后不良的重要决定因素[20]。但是肿瘤细胞自分泌的CCN2 能与相应受体或配体结合，抑制肿瘤生长及转移，所以在胰腺癌组织中，CCN2高表达的患者OS 长，CCN2 高表达反而提示患者预后良好[21]。同样在儿童髓母细胞瘤患者中，CCN2 低表达患者的无事件生存率低，CCN2 是髓母细胞瘤的一个独立于分子亚群的标记物，其分子转录水平在中枢神经系统肿瘤的微环境中是活跃的，降低CCN2 的表达可能会触发细胞迁移，潜在地促进中枢神经系统肿瘤的扩散，这是患者死亡的主要原因之一[22]。由此可见，CCN2 对不同肿瘤患者预后的影响存在一定的差异。本研究结果显示，癌旁组织中CCN2 低表达组的1 年及3 年 OS 和 DFS 均高于 CCN2 高表达组，进一步提示癌旁组织CCN2 高表达是肝癌患者重要的不良预后因素。作为TGF-β 信号通路的下游信号因子，CCN2 能够促进肝星状细胞向肌成纤维细胞分化，促进肝癌的发生[23]。Mazzocca 等[24]研究表明，依赖于TGF-β 的CCN2 表达下调能够通过抑制肿瘤相关成纤维细胞的增殖来减少肿瘤生长、血管内浸润和肝癌细胞的转移扩散，应用TGF-β 抑制剂可通过阻断肿瘤与肿瘤微环境之间的相互作用进而抑制肿瘤的恶性进展。同时CCN2 还可激活NF-kB 途径下调E-钙黏附蛋白，诱导肿瘤细胞的迁移[25]。值得注意的是，正反馈激活CCN2-MAPK-Id1 信号环促肝癌奥沙利铂耐药得到了实验验证，强调了通过抑制CCN2表达显著逆转了肝癌的化疗耐药性，抑制了肝癌细胞的恶性潜能[26]。这或许是导致肝癌患者术后的早期肝内复发与较差预后的原因。在本研究中，Cox 回归模型分析提示癌旁组织CCN2 表达和肿瘤远处转移是肝癌患者术后OS 的独立影响因素。后续分析结果进一步表明，癌旁组织中CCN2 高表达提示患者预后不良。因此，癌旁组织CCN2 表达水平可作为肝癌患者术后临床评估指标，在肝癌患者生存预后的评估中具有一定的临床应用价值。

本研究存在一定的局限性：第一，实验为单中心回顾性分析且样本量较小，会存在一定的偏倚，对结果产生一定影响；第二，实验过程同时受样本采集、实验室免疫组织化学检验技术等因素干扰，在一定程度上会影响结果的准确性。

综上所述，癌旁组织中CCN2 表达水平与肿瘤侵犯肝包膜、肿瘤直径、T 分期、远处转移及肝内早期复发密切相关，肝癌癌旁组织CCN2 高表达是影响肝癌患者术后OS 的独立危险因素，癌旁组织CCN2 低表达的肝癌患者预后更佳。由此推断，肝癌癌旁组织CCN2 可作为肝癌预后评估的临床标记物，可为进一步探索抗CCN2 治疗提高肝癌的疗效提供一定的理论支持。CCN2 在肝癌发生、发展过程中的具体作用机制还有待多中心、大样本量、不同分组（乙肝、肝硬化程度等）数据的进一步验证。