武 杰， 张 瑞， 许 旺， 张少华， 陈丽君

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室，银川 750004； 3.宁夏医科大学第二附属医院呼吸与危重症学科，银川 750001； 4.宁夏医科大学第二附属医院病理科，银川 750001）

最新研究显示，我国40 岁以上人群慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患病率为13.7%[1]。COPD 患者常伴有凝血-纤溶功能异常，导致机体处于高凝或血栓前状态，这种病理改变使患者易发生血栓性疾病或诱发慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD），频繁急性加重会加速疾病进展并导致患者死亡[2-5]。由此可见，COPD 具有高患病率和高病死率，已严重危害人类身体健康。COPD 的主要病理学表现为肺气肿和慢性支气管炎，随着病情进行性加重，最终可导致通气及换气功能障碍，造成机体缺氧。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是目前发现在缺氧状态下可以发挥活性的唯一一个高度特异性核转录因子，缺氧下快速表达，常氧下迅速降解，与人类众多缺氧性疾病密切相关[6]。本课题组前期研究[7]发现，COPD 患者外周静脉血中HIF-1α 水平高于健康者，并与机体缺氧程度相关，表明 HIF-1α 与COPD 的发生有关联。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是 HIF-1α 的下游靶基因之一，具有促进红细胞（red blood cell，RBC）增殖、分化及成熟的生理学功能[8]。EPO 的过量表达，可引起体内 RBC 总数和血红蛋白（hemoglobin，HGB）表达量增多，导致血液黏滞。本文通过脂多糖叠加烟熏的方法建立COPD 大鼠模型，首次探讨HIF-1α、EPO、RBC、HGB 与 COPD 髙凝状态之间的关系，以期为临床有效预防COPD 疾病进展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康SPF 级雄性SD 大鼠20只，平均体质量（200±20）g，由宁夏医科大学实验动物中心提供（SYXK 宁2015-0001），随机分为COPD 组和对照组，每组各10 只，均饲养于SPF级清洁环境。

1.1.2 试剂与仪器 脂多糖（美国Sigma：L2880），红河牌卷烟（云南省红云红河烟草有限公司），D-D、FIB、EPO 的 ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），Total RNA 提取试剂盒（Omega：R6834-01），逆转录试剂盒（Takara：RR036A），QPCR 试剂盒（Takara：RR820A），引物（上海生工有限公司）；自制染毒箱（70 cm×55 cm×35 cm），烟雾发生器（美国 Buxco），小动物肺功能仪（美国 Buxco），血常规分析仪（德国 SIEMENS），全自动凝血分析仪（德国 BE-Compact），紫外可见分光光度计（美国 Thermo），酶标仪（瑞士TECAN），荧光定量PCR 仪（美国 Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 COPD 大鼠模型制备 采用脂多糖叠加烟熏法制备 COPD 大鼠模型，第 1、14 天 COPD组大鼠气管内注入脂多糖（200 μg/次）；第 2～13、15～60 天将大鼠放入自制染毒箱被动吸烟（每天2 次，每次 75 min，两次间隔时间>3 h，每次 9 支香烟）；第61～90 天将大鼠放入自制染毒箱内被动吸烟（每天1 次，每次50 min，每次7 支香烟）；造模共90 d，对照组大鼠不做特殊处理。

1.2.2 大鼠肺功能测定 大鼠称重，给予2%戊巴比妥纳（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，于颈部正中切开气管，插入气管接管，放入体描箱，使用小动物肺功能仪测定肺总量（total lung capacity，TLC）、功能残气量（functional residual capacity，FRC）、200 ms 用力呼气量与用力肺活量比值（FEV200/FVC）、吸气阻力（airway resistance，RI）等参数。

1.2.3 大鼠血浆中 HIF-1α、EPO、APTT、PT、FIB、D-D 浓度检测 麻醉大鼠，固定于解刨板，心脏采血，使用枸橼酸钠抗凝管收集2 mL 血液，立即4000 r·min-1离心 10 min，取上层血浆，采用 BECompact 全自动凝血分析仪检测凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血酶原时间（activated partial thromboplastin time，APTT）表达量，采用ELISA 试剂盒按照说明书检测HIF-1α、EPO、血浆纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、D 二聚体（D-dimer，D-D）表达量。

1.2.4 大鼠全血中RBC、HGB 浓度检测 麻醉大鼠，心脏采血，使用EDTA 抗凝管收集2 mL 血液，立即颠倒混匀防止凝血，采用血常规分析仪检测大鼠RBC、HGB 表达量。

1.2.5 大鼠肺组织取材及病理学观察 采用空气栓塞法处死大鼠，开胸取左侧肺浸泡于10%中性福尔马林液，固定24 h，磷酸盐缓冲液冲洗，常规石蜡包埋连续切片，行HE 染色。取大鼠右侧肺上叶置于冻存管，经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱储存备用。

1.2.6 大鼠肺组织中 HIF-1α、EPO mRNA 浓度测定 取冻存组织，按Total RNA Kit 试剂盒说明书提取总RNA，经紫外分光光度计测定OD260/280 在1.8～2.0。按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。使用qPCR 试剂盒测定mRNA 浓度。HIF-1α 引物序列：上游 5"-CCTTCATCGGAAACTCCA-3"，下游 5"-CTGGGGCATGGTAAAAGA-3"；EPO 引物序列参考文献[9-10]，EPO 引物序列：上游 5"-CCCTGCTGCTTTTACTA-3"，下游 5"-ACATTTTCTGCCTCCTT-3"；内参 ACTB 引物序列：上游 5"-GAGAGGGAAATCGTGCGT-3"，下游5"-GGAGGAAGAGGATGCGG-3"。PCR 反应体系为 20 μL，TB Green Premix 10 μL，Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，DNA 模板 2 μL，灭菌水6.4 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，按下列程序循环 40 次：95 ℃变性 5 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min。采用仪器自带溶解曲线，以ACTB 作为内参，采用 2-ΔΔCt法测定 HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相对表达量。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 23.0 软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验，各参数间相关分析采用Pearson 相关性分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠肺功能参数比较

COPD 组大鼠 TLC、FRC、RI 均高于对照组，FEV200/FVC 低于对照组（P 均＜0.05），见表 1。

表1 两组大鼠肺功能参数比较（）

表1 两组大鼠肺功能参数比较（）

组别nTLC/mLFRC/mLFEV200/FVCRI/［cmH2O·（mL·s）-1］对照组 10 25.81±2.20 8.52±0.72 0.75±0.14 0.26±0.07 COPD 组 10 32.16±4.56 11.25±2.89 0.62±0.10 0.33±0.05 t 值 3.966 2.891 -2.461 2.774 P 值 0.002 0.016 0.024 0.013

2.2 两组大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB、APTT、PT、FIB、D-D 比较

COPD 组大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB、FIB、D-D 均较对照组升高，APTT、PT 均较对照组缩短（P 均＜0.05），见表 2。

2.3 两组大鼠肺组织病理学对比

与对照组大鼠相比，COPD 组大鼠肺组织HE 染色后表现为肺气肿和慢性支气管炎：肺泡明显扩张，肺泡间隔破裂并融合成大的囊腔，支气管壁周围可见大量炎细胞浸润，见图1A、图1B、图 1C。

2.4 两组大鼠肺组织中 HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相对表达量比较

与对照组比较，COPD 组大鼠肺组织中HIF-1α mRNA 和 EPO mRNA 表达量均升高（t=2.294、4.314，P 均＜0.05），见图 2A、图 2B。

2.5 大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 与 APTT、PT、FIB、D-D 的相关性分析

COPD 组大鼠血浆EPO 表达量与血浆HIF-1α、全血 RBC、全血 HGB 及血浆 D-D 表达量呈正相关（P 均＜0.05），与血浆 APTT、PT、FIB 表达量无相关性（P 均＞0.05），见表 3、表 4。COPD 组大鼠血浆 HIF-1α 表达量与血浆 FIB、D-D 表达量呈正相关（P 均＜0.05），与血浆 APTT、PT 表达量无相关性（P 均＞0.05）；COPD 组大鼠全血 RBC、HGB 表达量与血浆D-D 表达量均呈正相关（P均＜0.05），与血浆 APTT、PT、FIB 表达量均无相关性（P 均＞0.05），见表 4。

3 讨论

近年来国内多采用单纯烟熏或烟熏联合脂多糖的方法建立COPD 大鼠模型，但造模时间尚无统一标准。顾延会等[11]采用滴加2 次脂多糖联合烟熏28 d 的方法建立COPD 大鼠模型。本次造模过程中发现，造模1 个月时该组大鼠肺部未出现典型COPD 病理改变，仅有少量炎细胞浸润，表现为细支气管炎症，这表明造模时间过短可能无法得到稳定或典型的COPD 大鼠模型。造模3 个月时该组大鼠肺部出现典型COPD 特征性病理改变，肺泡明显扩张，肺泡间隔破裂并融合成大的囊腔，细支气管管壁可见大量炎细胞浸润，符合人类COPD 的主要病理学改变，说明造模时间越长，建立的COPD 大鼠模型越符合人类COPD 的病理改变。本文结果显示，COPD 组大鼠TLC、FRC、RI 均高于对照组，FEV200/FVC 低于对照组，证明COPD 组大鼠存在阻塞性通气功能障碍。由此可见，烟熏联合脂多糖3 个月的造模方法，可成功建立符合人类COPD 病理生理改变的COPD 大鼠模型。

表 2 两组大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 及凝血指标变化（）

表 2 两组大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 及凝血指标变化（）

组别nHIF-1α/（pg·mL-1）EPO/（μg·L-1） RBC/（×1012/L）HGB/（g·L-1）APTT/sPT/sFIB/（g·L-1） D-D/（mg·L-1）对照组 10 27.10±10.27 2.66±1.30 8.67±0.49 153.10±10.29 25.47±2.44 10.25±0.70 4.94±0.93 0.51±0.13 COPD 组 10 41.97±12.82 4.56±1.43 10.02±0.53 168.30±9.17 21.55±2.23 9.20±0.27 6.34±1.11 0.64±0.14 t 值 2.862 3.110 5.870 3.488 -3.754 -4.435 3.053 2.252 P 值 0.010 0.006 ＜0.001 0.003 0.001 ＜0.001 0.007 0.037

图1 两组大鼠肺组织HE 染色图片（×100）

图2 两组大鼠肺组织HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相对表达量比较

表 3 EPO 与 HIF-1α、RBC、HGB 的相关性分析

表 4 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 与凝血指标的相关性分析

在生理状态下，血液中存在凝血系统、抗凝血系统及纤溶系统之间的动态平衡，以保证血液在循环系统中的正常流动。血液的高凝状态是由于凝血功能亢进和（或）纤溶功能降低所致[12]。临床上常用APTT 反映内源性凝血功能，PT 反映外源性凝血功能，APTT、PT 时间缩短通常表示机体处于高凝状态。FIB 即凝血因子Ⅰ，可与凝血酶结合，交联形成纤维蛋白，导致血小板及红细胞聚集，高水平FIB 往往预示机体处于高凝状态[13]。D-二聚体是纤维蛋白原的降解产物，其水平升高，通常反映机体处于高凝及继发性纤溶亢进状态[14]。本研究发现，与对照组大鼠比较，COPD 组大鼠 APTT、PT 缩短，D-D、FIB 升高，与徐祎等[15-17]研究结果一致，说明COPD 疾病可以导致机体处于高凝状态。

本研究发现，COPD 组大鼠 HIF-1α、RBC、HGB 表达水平较对照组升高。HIF-1α 浓度升高表明机体处于缺氧状况。本研究中COPD 组大鼠血浆及肺组织中EPO 表达水平较对照组高，说明在缺氧条件下EPO 表达量增加。相关性分析显示，COPD 组大鼠血浆EPO 与全血 RBC、HGB及血浆HIF-1α 均呈正相关。Yu 等[18]在细胞实验中也证明，EPO 是 HIF-1α 的下游靶基因，缺氧条件下受其调控表达量增加。COPD 缺氧导致HIF-1α 表达水平升高，从而上调下游靶基因EPO 的高表达，进一步导致RBC、HGB 浓度升高，血液黏稠度增加，而血液高黏是导致肺动脉压升高的原因之一。因此，EPO、RBC、HGB 的改变促进了COPD 疾病的进展。

相关性分析还显示，COPD 组大鼠血浆D-D与血浆 HIF-1α、EPO、全血 RBC 及 HGB 呈正相关，血浆 FIB 与血浆 HIF-1α 呈正相关。HIF-1α、EPO、RBC、HGB 均与凝血指标存在相关性，说明HIF-1α、EPO、RBC、HGB 表 达 量 增 加 可 能 与COPD 凝血-纤溶功能异常相关，导致机体处于高凝或血栓前状态。可能在长期缺氧刺激下，HIF-1α-EPO 通路引起继发性红细胞增多，导致血液黏滞，红细胞变形性降低并聚集成团形成血栓，促进血小板和内皮细胞的黏附和聚集，损伤血管内皮细胞，启动血液凝血过程，从而导致COPD 高凝状态的发生[10]。

综上所述，脂多糖叠加烟熏3 个月造模，可成功建立符合人类COPD 病理生理改变的COPD大鼠模型。COPD 大鼠处于高凝状态，体内HIF-1α、EPO、RBC、HGB 高表达且均与凝血指标（PT、APTT、FIB、D-D）存在相关关系，其可能参与COPD 大鼠高凝状态的发生。