綦峥，杨红，张铁林，齐越，凌娜

哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心，哈尔滨 150076

我国每年生产抗生素21万t，其中48%用于农牧业[1]。畜禽养殖业中抗生素高浓度残留现象已成为社会关注的热点问题[2]。研究表明，大多数进入动物体内的抗生素不能被其自身完全吸收，30%～90%的抗生素通过畜禽排泄物或动物粪便排出，从而导致了土壤中抗生素残留的持续污染[3]。抗生素残留可诱导抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的产生，通过注射抗生素会导致其动物粪便中抗生素耐药基因的产生[4]。磺胺类抗生素(sulfonamides, SAs)在农牧业中的使用量很高，尤其在畜禽粪便中SAs的检出率也非常高[5]。在江苏省13个城市的80份猪场粪便样本中，磺胺二甲嘧啶(SMD)的检出率最高，达到50%以上，磺胺氯哒嗪(SPD)和磺胺嘧啶(SD)检出率都高于30%，三者的平均残留量分别为34.0、49.0和69.0 μg·kg-1[6]。残留的SAs药物对土壤中的微生物及微生物群落有重要的抑制作用[7]。SAs在牧区中的普遍使用，将导致耐药菌和ARGs在土壤环境中和动物之间传播，从而引起环境领域的广泛关注[8]，同时ARGs也被公认为一种新的污染物[9]。

为了解畜牧场内SAs及ARGs的污染物空间分布情况、分布规律及相关性，为畜牧场土壤的修复提出参考依据，本研究选取大庆市杜尔伯特蒙古自治区(以下简称杜蒙)作为研究对象，该畜牧场位于中国东北黑土地区，东北的黑土地区是目前世界上珍贵的三大黑土资源之一，以其有机质含量高、土壤肥沃和最适宜耕作而闻名于世，素有“谷物仓库”之称[10]。杜蒙地区拥有众多大小畜牧场，同时也是重要的奶源基地。本研究采用液相色谱-串联质谱法和实时荧光定量PCR法对该畜牧场土壤及粪便中的SAs含量及其ARGs丰度进行定量检测，对其空间分布规律以及SAs对磺胺类ARGs选择压力的相似性进行分析。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 样品采集

杜蒙位于黑龙江省西部，嫩江下游东岸。西邻泰来县，南与肇源县毗邻，北与齐齐哈尔市接壤[11]。采样的畜牧场为典型的东北牧区(图1)。该地区气候属于温带大陆性气候，冷暖适中，四季分明。研究区土地类型上部为黑色腐殖土、黄土和松砂层，下部为灰褐和黑色粘土。底部为灰白、黄灰色砂层和砂砾层，沉积厚度118 cm左右[12]。牧区总面积约为67 km2，其中畜牧场(存栏量约为200头)，在当地属于中型畜牧场。

图1 杜蒙某畜牧场采样区

在畜牧场采用网格式布设预采样点，运用荷兰钻304不锈钢土样采集器，在网格内选取土壤采样点10个(红色圆点)，采样深度分别为10 cm和50 cm(图2)，以及粪便样品5个(黄色圆点)。用GPS定位并记录，土壤样品各500 g，在每个采样点1 m2内取3个土壤样品，混匀后待检测。粪便样品每份500 g，装入牛皮纸密封袋中，保存在冰袋中冷藏。

图2 现场土壤和粪便采样分布点

1.2 样品检测

1.2.1 抗生素检测方法

采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，对土壤中的磺胺类包括磺胺醋酰(SA)、磺胺氯哒嗪(SPD)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲氧嘧啶(SEP)、磺胺脒(SG)、磺胺二甲嘧啶(SMD)、磺胺甲噻二唑(SDS)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺苯吡唑(SPP)、磺胺吡啶(SP)、磺胺噻唑(ST)、磺胺苯酰(SBA)和磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM’)共13种抗生素浓度进行检测。

称取1.00 g新鲜土壤样品(粪便样品)于10 mL试管中，以EDTA-Mcllvaine缓冲提取液提取3次，涡旋振荡超声离心，HLB小柱净化富集，3 mL甲醇洗脱后，氮吹至近干，1 mL甲醇复溶震荡，过0.22 μm有机系滤膜，经LC-MS/MS检测，色谱和质谱条件如表1所示。同时，每组另加2个全程序空白平行样，以校正各待测化合物在土壤基质中存在的不可忽略的基质效应。

表1 液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)的色谱和质谱条件

1.2.2 抗性基因检测方法

(1)DNA提取

样品中的基因组提取使用的试剂盒为TIANNAMP Soil DNA Kit(天根生化科技有限公司，中国)，按照说明书要求进行提取。

(2)实时荧光定量PCR检测

测定样品中3种磺胺类抗性基因sul1、sul2和sul3的多样性和丰富度，采用试剂盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ测定，qPCR的反应体系如表2所示。qPCR的反应条件：95 ℃ 30 s，一个循环。95 ℃ 5 s，40个循环。60 ℃ 30 s，40个循环。16S rRNA基因作为内参基因。相对丰度的计算采用2-ΔΔCT的方法进行计算，其中△CT=CT(目的基因)-CT(内参基因)[13]。

表2 qPCR反应体系

1.3 数据处理

数据通过Excel2016进行处理，采用ArcGIS10.5绘制SAs的空间分布规律图，Origin8.0对SAs浓度和ARGs相对丰度进行分析，利用Cluster3.0和Heatmap绘制热图，对SAs和ARGs进行聚类分析。

2 结果(Results)

2.1 磺胺类抗生素的空间分布规律

13种SAs在粪便及10 cm和50 cm的土层中浓度分布情况(图3)。整体上，土壤样品中的浓度分布不均匀，在粪便中，SEP、SMD、SPP、SBA和SDM’的检出率达到100%，抗生素的平均浓度为0.060～8.167 μg·kg-1；在10 cm土层中，SPP的检出率达到100%，抗生素的平均浓度为0.003～16.097 μg·kg-1；在50 cm土层中，SEP、SBA和SDM的检出率都达到100%，抗生素的平均浓度为0.002～6.981 μg·kg-1。其中，SPP是土壤中残留浓度最高的SAs，SPP在所有被检测的土壤样品中的检出率均高于96.7%，SPP在粪便中的浓度也最高。随土壤深度增加，SAs残留浓度减小，SAs在粪便样品和不同土层的浓度变化趋势与张昊[14]的研究结果相似，表明畜牧场土壤中SAs的来源很可能是畜禽粪便在畜牧场内的累积造成的。

图3 13种磺胺类抗生素(SAs)在粪便和不同深度土壤中的浓度

土壤中13种SAs的空间分布特征如图4所示，从污染物空间分布特征来分析可知：从垂直方向上，随着土壤深度的加深，土壤中SAs的浓度逐渐减小，呈下降趋势。在水平方向上，10 cm土层中SPP、SA、SG和SBA的空间分布结构相似，从西向东，污染特征呈逐渐减小的趋势，且主要污染集中在东部地区；SPD、SP和SMZ在10 cm土层的分布结构相似，污染特征主要集中在东北部；50 cm土层中SA、SG、SMZ、SPP、SDM、SD和ST的空间分布结构相似，从西向东污染程度逐渐增大，主要集中在东南部地区；整体水平上SAs在10 cm土层中由西到东空间分布污染情况逐步减小，主要聚集区域为畜牧场的西部，50 cm土层中，从西向东，污染特征逐渐增大，主要污染聚集区域为东北部地区，其余区域均无明显聚集现象。

图4 SAs污染的空间分布GIS图

2.2 磺胺类ARGs的相对丰度分布情况

3种磺胺类ARGs在10 cm和50 cm的土层中相对丰度分布情况如图5所示。整体上，土壤样品中的相对丰度含量分布不均匀，在10 cm土层中，sul1和sul2的检出率达到100%，ARGs的相对丰度范围为0.0043～0.2282；在50 cm土层中，3种ARGs的检出率都达到100%，ARGs的相对丰度范围为0.0013～0.1499。其中，sul2是土壤中残留含量最高的磺胺类ARGs，在10 cm土层中的相对丰度含量最高，随土壤深度增加，磺胺类ARGs相对丰度逐渐减小。这与贵州省养猪场的情况有所不同，在寇宏等[15]的研究中sul3是携带率较高的磺胺类ARGs。

图5 磺胺类抗生素抗性基因(ARGs)在不同土层中的相对丰度

2.3 磺胺类抗生素及抗性基因的相关性分析

对13种SAs和3种磺胺类ARGs (sul1、sul2和sul3)进行聚类分析，热图的纵向代表ARGs的相对丰度，横向代表13种SAs的聚类情况，反映了SAs对磺胺类ARGs是否有选择压力的相似性，从图6可知，SD、SMD、SP和SPP聚为一类，SPD、SEP、SMZ、SA、SDM和SBA聚为一类；SG、SDS和ST聚为一类。说明SD、SMD、SP和SPP对磺胺类ARGs的压力作用相似；SPD、SEP、SMZ、SA、SDM和SBA对磺胺类ARGs的压力作用相似；SG、SDS和ST对磺胺类ARGs的压力作用相似。

图6 土壤中SAs及ARGs的聚类分析

3 讨论(Discussion)

畜牧场土壤中SAs的使用加速了其ARGs的累积，目前ARGs的相对丰度与土壤中的菌群影响研究很多，结果单一相关性很低，因此，土壤中ARGs的生成是土壤中微生物、畜牧场中动物肠道菌群和土壤性质等因素的共同协作结果[16]。探究畜牧场土壤中SAs及ARGs的空间分布规律，为土壤修复和污染防治提供借鉴。

SAs在畜牧场土壤中广泛存在，从空间分布的污染情况可知，垂直方向上，SAs的浓度由上至下逐步升高，其中，SPP的平均浓度最高为8.167 μg·kg-1；水平方向上，10 cm土层和50 cm土层的抗生素整体浓度水平不高，主要聚集在畜牧场的东南部，在畜牧场的西南方向有小部分聚集。西南区域是成牛的主要活动区，东南方向是小牛的主要活动区，因此出现了2个较为明显的抗生素残留聚集区。从SAs浓度的分布情况可知，粪便中SAs的检测浓度高于土壤中的浓度。这与沈群辉[17]的研究结果相同，无论是养牛场、养鸡场或是养猪场，粪便中SAs的检测浓度均高于周边土壤中的浓度。

结果表明，抗生素的残留是导致土壤中磺胺类ARGs产生的主要原因之一，也是潜在ARGs的携带者。越来越多的研究表明，过量使用含有抗生素的残留物会显著增加土壤中的ARGs含量。抗生素残留量与ARGs相对丰度呈显著相关性[18-19]。不同的耐药菌影响了土壤中ARGs的分布和基因相对丰度，从而形成了不同的土壤中抗生素及其ARGs的空间分布特征[20-21]。土壤的性质和有机质浓度等环境因素也会影响ARGs的分布[22-26]。因此，对SAs及其ARGs在土壤中的危害问题仍有待进一步的实验研究，为今后土壤环境污染修复提供参考。

综上所述，本研究结果表明：

(1)土壤中13种SAs在土壤和粪便样品中均有检出，其垂直浓度的空间分布规律为粪便>10 cm深度土壤>50 cm深度土壤，空间分布污染特征主要集中在畜牧场的东南部。

(2)土壤中3种ARGs在10 cm和50 cm深度土层中均有检出，其基因相对丰度分布情况为10 cm深度土壤>50 cm深度土壤，且SAs对ARGs的压力作用呈现相似性。

(3)土壤中SAs及其ARGs的空间分布规律和SAs对ARGs压力作用的相似性分析，为深入研究畜牧场周边环境中ARGs的传播规律提供基础数据。