周丽娟 杨 朴 郑道都 孙劲璞（商丘医学高等专科学校，商丘 476000）

脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤疾病，近些年的发病率持续增高且患病人群逐渐呈现年轻化特征［1］。脑胶质瘤的增殖和侵袭性特别强，会透过血管壁及胶质细胞间的连接来浸润压迫并破坏脑组织［2］。脑胶质的手术难点在于其常与正常脑组织分界不清，导致手术切除不彻底，同时术后又极易复发［3］。目前针对脑胶质瘤的治疗依旧是个医学难题，又因其对放疗和化疗不敏感，所以针对脑胶质瘤的药物研究成为热点。脑胶质瘤往往会对正常脑神经产生压迫，导致脑神经细胞暂时的缺血和缺氧从而诱导脑神经死亡［4-7］，因此在针对脑胶质瘤的药物治疗过程中，如果对缺血性脑卒中具有一定的保护作用，这将非常有利于患者的治疗和康复。结合传统中医药的治疗方案，本研究发现秋水仙素具有对脑胶质瘤和缺血性脑卒中治疗的潜力。秋水仙素是萃取于百合科植物秋水仙的种子和球茎的一种植物碱，白色或淡黄色的粉末或针状晶体。最先用于治疗风湿病和痛风，但已有研究报道其对肿瘤具有一定的治疗效果。

因此本研究以U87细胞和HT22细胞为研究对象，探讨不同浓度秋水仙素对脑胶质瘤细胞和海马神经元细胞的抑制和保护作用，为秋水仙素在临床上治疗脑胶质瘤和缺血性脑卒中提供可靠的实验依据和药物作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 秋水仙素购自河南省食品药品检验所；高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液购自美国HyClone公司；蛋白酶抑制剂购自Roche美国公司；青链霉素混合液购自北京Solarbio公司；βactin、Caspase-3、Bcl-2、Cyclin-D1、Bax和p53以及PIK3/AKT抗体、兔二抗购自英国Abcam公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Advansta公司；CCK-8试剂盒和ROS检测试剂盒购自河南瑞祥生物公司；RNA逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自北京碧云天。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8增殖实验 收集对数期细胞，调整细胞数4×105个/孔铺板，随后分别加入不同浓度的秋水仙素（0、10、20、30、40 ng/ml），以正常培养细胞为空白对照组，37℃，5%CO2培养箱内培养12～60 h。结束后每孔加入20µl CCK-8试剂，避光3 h，摇床振荡15 min。设置酶标仪450 nm检测细胞CCK-8混合液OD值进行活力分析。

1.2.2 qRT-PCR使用TRIzol和氯仿提取RNA，RNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成性质稳定的cD‑NA。随后qRT-PCR检测目的基因相对β-actin的表达水平。反应条件设定如下：95℃预变性10 min；95°C退火10 s；60℃下退火20 s并在72℃下延伸35 s。2-ΔΔCt方法用于计算目的基因相对mRNA表达。引物序列如下。Caspase-3：Forward-5′-GCACCCAGCGA TGTAATAGA-3′，Reverse-5′-TTGGATGAAGGAGA‑ACCC-3′；Bcl-2：Forward-5′-CAAGGACCAACTACAACCA-3′，Reverse-5′-AGGGAAGGGTCAGTCAGGTT-3′；Cyclin-D1：Forward-5′-CCTGATGATGAATCAGCATTT-3′，Reverse-5′-GGAGATGATGGAGGCAAGG-3′；Bax：Forward-5′-CCTTTACTGAAGTTATTGATTTCTC-3′，Reverse-5′-GGCAGTTAGACTTTGATGCACTTT-3′；p53：Forward-5′-CTGGCGGTGAAACCTG-3′，Reverse-5′-CCCCTGCAAGGGTATCCCTGC‑GGT-3′；β-actin：Forward-5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，Reverse-5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.3 Western blot调整细胞数5×104个/ml接种至6孔板，80%细胞密度时收集细胞，PBS洗涤1 min加入加含有蛋白酶抑制剂的裂解液放置冰上裂解，30 min后高速离心吸取蛋白。蛋白定量完成后加上样缓冲液，沸水煮5 min。SDS-PACE电泳后进行转膜，转膜成功后用脱脂牛奶进行封闭，PBST清洗，均为1∶1 000稀释一抗，室温孵育1 h后4℃过夜。次日反复清洗条带，加二抗室温孵育90 min，PBS反复冲洗，发光拍照。

1.2.4 OGD细胞模型构建HT22细胞体外正常培养待细胞密度达到30%左右，预先细胞给药5、10、15、20、30和40 ng/ml秋水仙素处理12 h。随后放入三气培养箱，培养条件90%CO2、5%N2、5%O2，换至无血清培养液，培养8 h。取出细胞换成正常培养液，正常细胞培养箱培养24 h，观察细胞活力、ROS变化和线粒体膜电位变化。

1.2.5 ROS活性检测HT22细胞体外正常培养待细胞密度达到30%左右，预先细胞给药30 ng/ml秋水仙素处理12 h。随后放入三气培养箱，培养条件90%CO2、5%N2、5%O2，换至无血清培养液，培养24 h。结束后每孔加入20µl ROS检测试剂，避光1 h，摇床振荡15 min。设置酶标仪570 nm检测细胞OD值进行活力分析。

1.2.6 线粒体膜电位检测HT22细胞体外正常培养待细胞密度达到30%左右，预先细胞给药30 ng/ml秋水仙素处理12 h。随后放入三气培养箱，培养条件90%CO2、5%N2、5%O2，换至无血清培养液，培养24 h。结束后每孔加入30µl JC-1检测试剂，避光12 h，随后激光共聚焦观察线粒体膜电位变化。

1.3 统计学分析 所有数据应用SPSS17.0软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较用t检验，多组件比较用F检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 秋水仙素抑制U87细胞增殖能力 检测不同浓度秋水仙素对脑胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用，以确定最佳的药物作用浓度。结果发现秋水仙素对U87细胞增殖抑制作用随着秋水仙素给药浓度的增加而增加（P＜0.05），同时发现给药浓度达到30 ng/ml时秋水仙素抑制作用最强（P＞0.05），因此后续对U87细胞作用浓度选为30 ng/ml。见图1。

图1 不同浓度秋水仙素对脑胶质瘤U87细胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of different concentrations of col-chicine on proliferation of glioma U87 cells

2.2 秋水仙素抑制PIK3/AKT信号通路和抑制U87细胞凋亡蛋白表达qRT-PCR和Western blot检测秋水仙素给药后对PIK3/AKT信号通路的影响以及下游促癌基因Caspase-3、Bcl-2和Cyclin-D1和抑癌基因Bax和p53的表达。结果发现秋水仙素可以有效抑制促癌基因Caspase-3、Bcl-2和Cyclin-D1表达（P＜0.05），促进抑癌基因Bax和p53的表达（P＜0.05），同时抑制PIK3和AKT的磷酸化（P＜0.05），从而抑制PIK3/AKT信号通路的激活。提示秋水仙素是通过阻滞PIK3/AKT信号通路的激活从而抑制U87细胞的增殖作用。见图2、3。

图2 PCR检测秋水仙素对脑胶质瘤U87细胞PIK3/AKT信号通路下游相关蛋白的影响Fig.2 Effect of colchicine on PIK3/AKT signaling down-stream related proteins in glioma U87 cells detected by PCR

图3 Western blot检测秋水仙素对脑胶质瘤U87细胞PIK3/AKT信号通路下游相关蛋白的影响Fig.3 Effects of colchicin on PIK3/AKT signaling path-way and its downstream related proteins in glioma U87 cells

2.3 秋水仙素预处理可提高OGD诱导HT22细胞活力10、20、30、40和50 ng/ml秋水仙素预处理对OGD诱导HT22细胞活力具有明显的保护作用（P＜0.05），而20 ng/ml浓度秋水仙素对OGD诱导HT22细胞活力开始产生抑制作用，30 ng/ml时抑制作用最强。说明秋水仙素在30 ng/ml时对HT22产生细胞毒性。因此后续HT22细胞秋水仙素给药浓度为30 ng/ml。见图4。

图4 不同浓度秋水仙素对OGD模型HT22细胞活力的影响Fig.4 Effect of different concentrations of colchicin on vi-ability of HT22 cells in OGD model

2.4 秋水仙素预处理降低OGD诱导HT22细胞ROS和线粒体膜电位的变化OGD诱导会刺激细胞氧化应激反应和线粒体的凋亡，活性氧ROS和线粒体膜电位的变化分别反映了这两种细胞的生理反应，而细胞在发生氧化应激反应和线粒体的凋亡时会产生NO来减缓ROS的产生和线粒体膜电位的降低。检测结果发现与对照组相比，秋水仙素预处理组HT22细胞NO表达显著增多（P＜0.05），ROS含量明显降低（P＜0.05），同时线粒体膜电位也显著降低（P＜0.05）。说明秋水仙素预处理可以有效缓解OGD诱导的HT22细胞的氧化应激和线粒体凋亡。见图5、6。

图5 30 ng/ml秋水仙素预处理对OGD模型HT22细胞ROS表达的影响Fig.5 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on ROS expression in HT22 cells of OGD model

图6 30 ng/ml秋水仙素预处理对OGD模型HT22细胞线粒体膜电位影响Fig.6 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on mito-chondrial membrane potential of HT22 cells in OGD model

2.5 秋水仙素降低MMP-9和CRP的表达MMP-9和CRP是发生缺血性脑卒中的标志细胞因子，OGD模型下，秋水仙素预处理后，ELISA检测各组细胞培养液中MMP-9和CRP的变化，结果发现秋水仙素可以有效抑制MMP-9和CRP的表达（P＜0.05），减缓OGD诱导HT22细胞MMP-9和CRP的分泌。见图7。

图7 30 ng/ml秋水仙素预处理对OGD模型HT22细胞MMP-9和CRP的影响Fig.7 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment onMMP-9 and CRP in OGD model HT22 cells

2.6 秋水仙素抑制PIK3/AKT信号通路和抑制OGD诱导HT22细胞凋亡30 ng/ml秋水仙素可以减缓OGD诱导HT22细胞凋亡。qRT-PCR和Western blot检测秋水仙素预处理后OGD诱导HT22细胞内PIK3/AKT信号通路相关蛋白的变化，结果发现秋水仙素同样通过抑制AKT的磷酸化（P＜0.05），抑制促凋亡因子Capase-3、Bcl-2和Cyclin-D1表达（P＜0.05），从而缓解OGD诱导HT22细胞凋亡。见图8、9。

图8 PCR检测30 ng/ml秋水仙素预处理对OGD模型HT22细胞PIK3/AKT信号通路下游相关蛋白的影响Fig.8 PCR detection of 30 mg/ml colchicin pretreatment on OGD model effects of PIK3/AKT signaling pathway in HT22 cells

图9 Western blot检测30 ng/ml秋水仙素预处理对OGD模型HT22细胞PIK3/AKT信号通路下游相关蛋白的影响Fig.9 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on down-stream related proteins of PIK3/AKT signaling pathway in HT22 cells

3 讨论

脑胶质瘤是临床上人颅内常见原发性恶性肿瘤，近些年发病率逐渐增高且趋于年轻化［8］。脑胶质瘤侵袭性强，常通过侵袭血管壁及胶质细胞间的连接来浸润、压迫和破坏脑组织［2，9］。由于其与正常脑组织分界不清，手术难以彻底切除，术后极易复发［9-10］。而其对放疗及化疗的敏感性均欠佳，故患者预后差，死亡率高［9，11］。目前临床上针对脑胶质瘤尚无有效的药物，因此，针对抗脑胶质瘤药物的研究就显得尤为重要。脑胶质瘤常常会压迫脑神经，造成神经元细胞缺血再灌注造成脑卒中。因此脑卒中常常伴随着脑胶质瘤的发生。脑卒中是人类灾难性疾病，具有高发病率、高死亡率和高致残率等特点，是世界范围内死亡和长期致残的三大原因之一［9］，同时也是世界上单病种导致成人后天功能障碍的首位原因［12］。脑卒中主要原因是脑缺血再灌注引起的［9］。而脑缺血再灌注损伤机制复杂，氧化还原平衡的破坏是其重要的病理特征［13］。因此，探索高效的抗氧化神经保护及对脑缺血再灌注损伤的改善和治疗具有重要的研究意义和临床价值。

秋水仙素是萃取于百合科植物秋水仙的种子和球茎的一种植物碱［14］。它是白色或淡黄色的粉末或针状晶体，最先用于治疗风湿病和痛风，但已有研究报道其对肿瘤具有一定的治疗效果［15］，但是关于秋水仙素治疗脑胶质瘤和缺血性脑卒中的作用如何，其如何发挥作用的分子机制尚不清楚。因此本研究以U87细胞和HT22细胞为研究对象，探讨了不同浓度秋水仙素对脑胶质瘤细胞和海马神经元细胞的抑制和保护作用。

本研究首先研究了秋水仙素对U87细胞增殖的影响，初步确定秋水仙素的作用浓度，结果发现30 ng/ml的秋水仙素显著抑制U87细胞增殖作用，同时对OGD模型中HT22具有一定的保护作用。为了研究秋水仙素对脑胶质瘤细胞的抑制作用机制，我们检测了肿瘤经典信号通路PI3K/AKT在秋水仙素给药后U87细胞中的变化，结果发现秋水仙素抑制了AKT的磷酸化，同时降低下游促癌基因的表达，促进下游抑癌基因的表达。这提示秋水仙素通过PI3K/AKT信号通路发挥抑癌作用。同时我们检测了HT22细胞在OGD模型中秋水仙素对PI3K/AKT的影响，结果同样显示秋水仙素抑制PI3K/AKT信号通路以及下游促凋亡基因的表达。这说明秋水仙素在对脑胶质瘤发挥作用的同时对脑缺血再灌注损伤有很好的改善作用，且都是通过PI3K/AKT信号通路来实现的。同时在HT22细胞OGD模型中秋水仙素抑制了ROS的释放，降低线粒体膜电位从而减少细胞的凋亡，并且对脑缺血再灌注损失标志蛋白MMP-9和CRP同样具有抑制作用。

综上所述，本研究结果中秋水仙素通过PI3K/AKT信号通路抑制脑胶质瘤细胞增殖，同时有效缓解脑缺血再灌注引发的损伤，但是秋水仙素在脑胶质瘤和脑缺血再灌注中发挥作用的首触靶分子是哪个基因，又是如何进一步激活下游PI3K/AKT信号通路的，这将是我们下一步的研究重点。